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1、重组水通道蛋白9对非酒精性脂肪肝病细胞模型的作用王川，袁媛，姜政，王丕龙(400016重庆，重庆医科大学附属第一医院消化内科)摘要I目的 构建人水通道蛋白9(叫UaglyCerOPorin9,AQP9)重组质粒，验证其在L-02肝细胞中的表达，并检测其对非酒 精性脂肪肝病(nonalcoholic fally liver disease, NAFLD)细胞模型的作用。方法 从人肝脏组织中提取总RNA, RT-PCR获得AQP9 基因，克隆到载体PEGFP-Nl上，构建重组质粒PEGFP-NI-AQp9。将其转染L-02细胞，通过荧光显微镜观察其转染情况，RT-PCR 和WeStembIot检测
2、AQP9基因在细胞中的表达。通过油红O染色，测定甘油二酯、游离脂肪酸及甘油含量检测其对L-02细胞脂肪变 性模型的作用C结果成功构建PEGFP-Nl-AQP9重组质粒，并能在L-02细胞中表达，将其转染L-02细胞脂肪变性模型后，油红O 染色可见油酸pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高，油酸pEGFP-NI-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂 肪酸及甘油含量分别为5.4350.337 mmol/L、2.0160.144 mmol/L&l.4850.113 nmolL,而油酸组分别为3.2180.220 mmol/L、 L5380.193mmolL及1.024 0.1
3、48mmolL,两者之间有显著的差异(PVo.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加 重结论AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病。I关键词水通道蛋白9；非酒精性脂肪肝病；重组质粒：基因治疗中图法分类号R575.HR589.2文献标志码I AThe study of recombinant AQP9 in nonalcoholic fatty liver disease cellular modelsWang Chuan, Yuan Yuan. Jiang Zheng, Wang Pilong (Department of Gastroenterology, the Fir
4、st Affiliated Hospital, Chongqing Medical University 400016)Abstract Objective Tb construct the recombinant eukaryotic expression plasmid of human aquaglyceroporin9 (AQP9), to examine its expression in eukaryotic expression liver cell L-02 and to detect its effect in nonalcoholic fatty liver disease
5、 (NAFLD) cellular models, in order to lay the foundation for elucidating the human AQP9 in pathogenesis of NAFLD. Methods Total mRNA was extracted from human hepatic tissue, the human AQP9 gene was obtained by RT-PCR and cloned into pEGFP-N 1 vector, and then the recombinant plasmid pEGFP-N 1 -AQP9
6、was transfected into L-02, the transfection was detected by fluorescent microscopy, the expression of AQP9 gene in cell was detected by RT-PCR and Western Blot, detected its effect in NAFLD cellular models by Oil Red O staining, determination of TG, FFA and glycerol content. Results The recombinant
7、plasmid pEGFP-N 1-AQP9 was constructed and it could express in L-02, it was transfected into the steatosis models of L-02 cell, Oil Red O staining showed oil red/transfected by pEGFP-N 1-AQP9 group intracellular lipid content was significantly increase than oil red group, oil red/transfected by pEGF
8、P-N 1 -AQP9 group intracellular triglycerides, free fatty acids and glycerol content were 5.435 0.337 mmolL, 2.016 0.144 mmol/L and 1.485 0.113 mmolL, while Oleic acid group were 3.218 0.220 mmol/L, 1.538 .193 mmol/L and 1.024 0.148 mmol/L, there was a significant difference (P0.01), it showed incre
9、ase the expression of AQP9 could aggravate the degree of steatosis. Conclusion AQP9 abnormal increase can cause or worsen NAFLD, lay the foundation for further study on the gene therapy of NAFLD with AQP9.Key words Aquaglyceroporin9; AQP9; Nonalcoholic fatty liver disease; Recombinant vector; Gene t
10、herapySupported by the General Program of National Natural Foundation of China (); the Medical Science and Technology Research Project of Chongqing Health Bureau (2010-2-100). Corresponding author: Jiang Zheng, Tel: (023), E-mail:基金项目国家自然科学基金面上项目0：重庆市卫生局医学科学技术研究项目(渝卫科教20102-100)通信作者姜政,电话：(023), E-ma
11、il:非酒精性脂肪肝病是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征。目 前针对非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic falty liver disease,NAFLD)还没有特效药物，随着西方化的饮食方式及 生活水平的提高，使其发病率迅速增加，已经成为危害人类健康的主要消化系疾病之一P,对其治疗和预防 的迫在眉睫。NAFLD与脂肪重新分布有关，而脂肪的动员运输和肝脏的摄取又与水通道蛋白(aquaglyceroporin9, AQP9)相关阳AQP9主要表达于肝细胞窦状隙膜上，能将血液中甘油转运进入肝细胞，大量甘油进入肝细 胞将引起脂肪合成及蓄积增加，从而导致脂
12、肪肝的形成。本研究通过RT-PCR从人肝脏组织中获得AQP9基因， 构建重组质粒PEGFP-NI-AQP9,并验证其在COS-7细胞及L-02细胞中的表达，通过油红O染色，测定细胞内脂 质含量检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用。为进一步研究AQP9在非酒精性脂肪肝病的发生、发展中的作 用奠定基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞人肝脏组织取自本院肝胆外科手术患者(经患者同意)；人正常肝细胞株L-02购自中科院上海细胞库。1.1.2 主要试剂及工具酶RNAiSoPhis、RT-PCR试剂盒，限制性内切酶购自大连TaKaRa公司；凝胶回收纯化试剂盒，质粒小量提取试剂盒，无内毒素质
13、粒小量提取试剂盒购自美国OMEGA公司；油酸购自美国Sigma 公司；LiPOfeCtamine 2000, Opti-MEM培养基购自美国InVitrOgen公司；兔抗人AQP9抗体购自美国Santa Cruz 公司；甘油三酯检测试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司：游离脂肪酸检测试剂盒购自南京建成生物_ 程研究所；甘油含量GPO-POD酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建根据NCBl中人AQP9的基因序列（ABOO8775）,设计AQP9巢式PCR外侧上游引物：5,-gAtttcgggttctaagtcgc-3,外侧下游弓I物：5二GAGA
14、ATCCCAAACTGACTGC-3,内侧上游引物： 5-GGAAGATCTGATGCAGCCTGAGGGAG-3 , 内 侧 下 游弓I物：5,0.05差异没有统计学意义。2 结果2.1 总RNA的提取肝脏总RNA行10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S和5 S三个条带，分光光度计结果：Z)(260nm)/ D (28Onm)为 1.95, D (260nm)/ D (230nm) 1.31,符合实验需求。2.2 RT-PCR扩增目的基因123AQP9 -actinPCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，在888 bp附近有特异性条带，提示扩增产物为人AQP9片段(图1 )。1:
15、DNA 标准(DL 2000); 2-3: RT-PCR 产物图1 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果2. 3 重组质粒PEGFP-Nl-AQP9的鉴定2.1.1 PCR鉴定 以重组质粒菌液为模板，加入AQP9内侧引物进行PCR反应，同时以空质粒菌液、DH5 菌液及CidH2O为对照，产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示，重组质粒菌液在888 bp处有一特异性AQP9 条带，而对照组未见条带，初步说明重组质粒构建成功。2.1.2 酶切鉴定 PEGFP-Nl-AQP9与PEGFP-Nl分别进行单酶切及双酶切，酶切产物行10 g/L琼脂糖凝胶 电泳。结果显示，重组质粒经双酶切可切出AQP9目
16、的条带(888 bp),而空质粒未切出目的条带(图2),上 述结果再次证明重组质粒构建成功。1 2 34 5 6 78 9AQP91,9: DNA 标准（DL 10000） :2: pEGFP-N1 ： 3: pEGFP-N1-AQP9; 4：单降切 pEGFP-N1; 5:单酶切 pEGFP-N1-AQP9:6:双酶切 PEGFP-N1 ： 7:双峰切 PEGFP-Nl-AQP9； 8: AQP9 PCR 产物 图2重组质粒酶切鉴定结果2.3.3测序鉴定测序结果经分析，发现1个碱基发生突变，45位：AG,为无义突变。充分证明AQP9已正确插入PEGFP-N1载体中，pEGFP-N 1-AQP
17、9重组质粒构建成功。2.4 重组质粒在L-02细胞中的表达2.4.1 绿色荧光检测重组质粒的表达 荧光显微镜下观察，pEGFP-Nl-AQP9转染组和PEGFP-Nl转染组均可 见到绿色荧光（图3）, dd+O转染组、未处理L-02细胞组未见到绿色荧光。说明重组质粒已经转染进入L-02细 胞并表达融合蛋白。A： PEGFP-Nl-AQP9 转染组：B: PEGFP-Nl 转染组图3荧光显微镜观察L-02细胞中绿色荧光蛋白表达（X 200）2.4.2 RT-PCR检测目的基因的表达PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示，PEGFP-Nl-AQp9转 染组、pEGFP-Nl转染组、JdH
18、2O转染组及未处理L-02细胞组都能够扩增出AQP9条带（888 bp）,其中PEGFP-NI-AQP9转染组AQp9条带最亮（图4）,说明PEGFP-Nl-AQP9转染成功，并能在L02细胞中表达。12345 AQP9-actin1: DNA 标准（DL2000）; 2： PEGFP-Nl-AQP9 转染组；3: PEGFP-Nl 转染组：4： ddHQ 转染组：5:未处理L-02细胞组图4 RT-PCR检测重组质粒在L-02细胞中的表达2.4.3 Western blot检测目的蛋白的表达 AQP9蛋白Mr约为29 IO3,在线软件预测GFP分子量约为27X IO3,融合蛋白GFP/AQP
19、9分子量约为56 IO3,经Western blot检测，各组细胞在42 1（）3位置的.actin条带 均清晰，PEGFP-NI-AQP9转染组、PEGFP-Nl转染组、ddHzO转染组及未处理L-02细胞组均在29X IO?可见 AQP9条带，PEGFP-NI-AQP9转染组在56X1O3可见GFP/AQP9融合蛋白条带（图5）,说明重组质粒在L-02 细胞中表达AQP9蛋白并与绿色荧光蛋白融合。GFPAQP9-actinAQP91: PEGFP-Nl-AQP9转染组；2: PEGFP-Nl转染组；3: ddH20转染组；4：未处理L-02细胞组图5 Western b I ot检测重组质
20、粒在L-02细胞中的表达2.5 MTT法确定油酸最适浓度当油酸浓度大于20gml,吸光度值明显下降，细胞活性显著降低（表1）,因此确定20 gml的油酸浓度作 为诱导L-02细胞脂肪变性的最适浓度。表1不同浓度油酸对L-02细胞活性的影响油酸浓度0 gml10 gml20 gml30 gml40 gml50 gml吸光度值0.43+0.040.48+0.040.47+0.050.44+0.030.40+0.050350.05aa : P 103可见GFP/AQP9融合蛋白条带，油酸pEGFP-Nl-AQP9转染组、油酸pEGFP-Nl转染组、油酸AldHzO转染组及油酸组在29X103可见较亮
21、AQP9蛋白条带，而未处理L-02细胞组AQP9蛋白条带最淡（图8）。说明油酸诱导L-02细胞脂肪变性能使其AQP9蛋白表达升高，而转染PEGFP-Nl-AQP9后，可使其AQP9蛋白表达量进一步增加。1:未处理L-02细胞组：2:油酸组；3:油酸组pEGFP-NI-AQP9转染组：4：油酸pEGFP-N1转染组：5:油酸ddH20转染组图8 Western blot检测各组AQP9蛋白表达情况2.6 油红。染色正置显微镜下观察：油酸pEGFP-Nl-AQP9转染组L-02细胞内可见大量橘红色脂滴，伴较多脂滴融合现象, 脂肪变性程度较重；油酸pEGFP-Nl转染组、油酸ddHzO转染组及油酸组
22、可见中等量橘红色脂滴，伴少许脂滴 融合，脂肪变性程度较轻；未处理L-02细胞组未见橘红色脂滴（图9）。表明增加L-02细胞的AQP9表达量能使 其脂肪变性程度加重。a:未处理L-02细胞组；b:油酸组：c:油酸组pEGFP-Nl-AQP9转染组；d:油酸pEGFP-N1转染组:e:油酸ddH20转染组图9油红0染色观察各组LF2细胞中脂质含量的变化2.7 甘油三脂、游离脂肪酸及甘油含量测定结果显示，油酸可诱导L-02细胞脂肪变性，使其TG、FFA及甘油含量增加，未处理L-02细胞组与其他组比 较，有显著的差异（P0.05）油酸pEGFP-Nl-AQP9转染组与油酸组比较，有显著的差异（P0.0
23、1）（表2）。说明增加 AQP9表达量能使L-02细胞中TG、FFA及甘油含量增加，表明AQP9在肝细胞脂肪变性中起着重要的作用。表2各组甘油三酯、游离脂肪酸、甘油含量的测定（mmol/L）组别甘油三脂游离脂肪酸甘油未处理L-02细胞组l.3660.239a0.493 0.12440379 0.092*油酸组3.2180.2201.538 0.193I.O24O.I48油酸pEGFP-N 1-AQP9转染组5.435 0337a2.0160.144i1.485 0.113*油酸pEGFP-NI转染组3.505 0.304).634+0.2240.973 0.163油酸ddHQ转染组3.259+
24、0.2531.517+0.1571.113+0.252a: P AQP9和AQPl0,它们不仅 对水分子有通透性，还对尿素、甘油甚至某些无机离子有通透性，它们在调节的机体的甘油运输和脂质代谢方 面具有重要的意义，与NAFLD、肥胖、代谢综合征及胰岛素抵抗关系密切。肝细胞膜上存在三种水甘油蛋白通道：AQP3、AQP7及AQP9,其中AQP9表达量最高。肝细胞膜上的 AQP9能将血液中甘油转运进入肝细胞，在肝细胞内以甘油和游离脂肪酸为原料合成甘油三酯，参与了甘油从 脂肪细胞到肝细胞的转移，实现了脂肪的重新分布。如果AQP9异常升高，大量甘油进入肝细胞将引起脂肪 合成和蓄积增加，从而导致脂肪肝的形成
25、。AQP9功能异常也将阻碍糖异生过程而导致低血糖，同时也与胰 岛素及代谢综合症抵抗密切相关阳叽 降低肝细胞AQP9的表达可有效阻断甘油进入肝细胞，从而治疗和预防 NAFLD的发生、发展。同时AQP9也作为一些药物吸收的通道，如化疗药物三氧化二碑山一，诱导肿瘤细胞 膜上AQP9表达量增加可有效提高化疗药物的疗效，并减少用药剂量，从而降低药物的毒副作用，为肿瘤的疗 效提供了一个新的思路【。本课题成功构建了重组质粒PEGFP-NI-AQP9。经测序分析,有1个碱基发生突变，45位：AG,为无义 突变。重组质粒pEGFP-Nl-AQP9能在在L-02肝细胞中表达并且能够被兔抗人AQP9抗体所识别。通过
26、油酸诱 导建立L02脂肪变性细胞模型，将重组质粒转染细胞模型后，发现增加L02细胞的AQP9表达量能使其脂肪 变性程度加重，细胞内脂质含量增加，甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量升高。证明AQP9异常升高能够引起 或加重NAFLD,提示以AQP9为靶点预防和治疗NAFLD具有良好的应用前景,为进一步研究AQP9对NAFLD 的基因治疗奠定基础。参考文献：1 Kim HK, Park JY, Lee KU, et al. Effect of Body Weight and Lifestyle Changes on Long-Term Course of Nonalcoholic Fatty Live
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