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1、微生物限度检查方法验证方案1。目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行,若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2。范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证.3。规范性引用文件:根据中国药典2010年版二部附录J微生物限度检查法的要求,由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方
2、法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。4。验证实施:4.4.1试验前的准备：4.4。1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0。22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等,用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121,灭菌30min，在3天内使用。4.4。1.2试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)等脱水培养基,按照相应的配制说明,
3、用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121，灭菌15min，在3周内使用。4.4。1。3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、0。9无菌氯化钠溶液、0。05（ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装,在121，灭菌15min，在3周内使用。4。4。2试验菌的制备和稀释：4。4.2。1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4。4.2。1。1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中,在3035培养1824小时；取白色念
4、珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在2328培养2448小时;取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天。4。4。2.1。2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的均匀培养物(菌悬液），用0。9无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌50100cfu的试验菌液.在黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养基中,加入35ml含0。05（ml/ml)聚山梨酯80的0。9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬液）,用含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌50100cfu的试验孢子液.4.4。2。1.3上述菌液在供试验的同时，取1m
5、l注皿、培养、计数；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于3035倒置培养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于2328倒置培养72小时.4。4。2.2控制菌检查方法验证用菌液:4.4。2。2。1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中,生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在3035培养1824小时.4。4.2。2。2取上述均匀培养物（菌悬液），用0。9无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每1ml含菌10100cfu的试验菌液.4。4。2。2.3上述菌液在供试验的同时，取1ml注皿
6、、注入营养琼脂培养基，于3035倒置培养48小时，计数。4。4。3供试液的制备:4。4。3。1根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。4。4。3。2，取供试品养胃舒软胶囊5g,加至含溶化的(温度不超过45）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入45pH7。0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。4.4。3。3供试液的制备如需用水浴加温时，温度不得超过45，时间不得超过30min.5。5。4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法：4。4.4。1验证试验分4组，照微生
7、物限度检查法操作，分别用3个不同批号样品进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率.4。4.4。2试验组：4。4.4。2.1平皿法:分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。4。4。4。2.2薄膜过滤法:取1:20的供试液110ml，加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤(水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。用适宜的冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量约100ml,总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入一种试
8、验菌液1ml（含菌50100CFU），滤过,取出滤膜,菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。每株试验菌平行制备2个平板。4。4.4。3菌液组：取试验菌液各1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。5.5.4。4供试品对照组：4。4。4。4.1平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中,每种培养基平行制备2个平皿。4。4.4。4。2薄膜过滤法：取1：20的供试液110ml（取用量同试验组），加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤(水溶性
9、供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥)。用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于经预培养合格的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上,每种培养基平行制备2个平板。4。4。4。5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。4。4。4。5。1平皿法:分别取1ml稀释剂或缓冲液和1ml试验菌液(含菌50100CFU)，注入同一直径90mm的灭菌平皿中,每株试验菌平行制备2个平皿。4。4。4。5.2薄膜过滤法:每个滤桶内加入1
10、00ml稀释液，按薄膜过滤法过滤,用冲洗液冲洗滤膜,冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，在最后一次冲洗液中加入一种试验菌液1ml(含菌50100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板,白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板.每株试验菌平行制备2个平板。4.4.4.6倾注培养基:在菌液组各平皿中分别倾注1520ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，其中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基,混匀，凝固.4.4。4.7培
11、养观察：用于细菌计数的营养琼脂培养基平板，倒置于3035的培养箱中,培养48小时;用于霉菌、酵母菌计数的玫瑰红钠琼脂培养基平板，倒置于2328的培养箱中，培养72小时.逐日观察菌落生长情况,点计菌落数。4。4。4.8菌落计数：将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察并记录结果.4.4。4。9计算回收率试验组回收率试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数菌液组的平均菌落数100%稀释剂对照组回收率稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%4.4.4。10结果判定:在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于70。试验组的菌回收率均不低于7
12、0，则照该供试液制备方法和计数法测定。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70,则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。4。4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：第一次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品:供试品g（ml)，加稀释剂ml，制成1:供试液;取供试液ml,冲洗次数次,每膜 冲洗量ml。 非水溶性供试品:供试品 g(ml）,加乳化剂（名称 ;批号 ) g（ml)，加稀释剂ml，制成1：供试液；取供试液ml，冲洗次数 次，每
13、膜冲洗量ml. 其它： 。 技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组(cfu）12平均供试品对照组（cfu)12平均试验组回收率(%）稀释剂对照组回收（%)结论检查人/日期复核人/日期第二次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品：供试品g（ml），加稀释剂ml，制成1：供试液；取供试液ml，冲洗次数次，每膜 冲洗量m
14、l. 非水溶性供试品:供试品 g（ml），加乳化剂（名称 ；批号 ） g（ml），加稀释剂ml，制成1：供试液;取供试液ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量ml。 其它： . 技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组（cfu)12平均供试品对照组（cfu）12平均试验组回收率（%）稀释剂对照组回收（)结论检查人/日期复核人/日期第三次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理
15、 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品：供试品g(ml)，加稀释剂ml,制成1：供试液；取供试液ml，冲洗次数次，每膜 冲洗量ml。 非水溶性供试品:供试品 g（ml）,加乳化剂（名称 ；批号 ） g(ml)，加稀释剂ml，制成1：供试液；取供试液ml，冲洗次数 次,每膜冲洗量ml。 其它: . 技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组（cfu)12平均供试品对照组（cfu
16、）12平均试验组回收率（%)稀释剂对照组回收（%）结论检查人/日期复核人/日期4.4。5控制菌检查方法验证方法：4。4。5.1根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌,选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,采用大肠埃希菌作为验证菌株.验证试验分3组，分别用3个不同批号样品或同一批号样品进行3次独立的平行试验。4.4.5。2试验组：4.4.5。2。1平皿法：取1：10的供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2)和1ml试验菌液（含菌10100CFU）加入同一增菌培养基中,按相应控制菌的检查方法进行检查。4.4。5.2。2薄膜过滤法:取1：10的供试液10ml（相当于供试品1
17、g、1ml、10cm2），按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥)。用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入1ml试验菌液（含菌10100CFU）,滤过，取出滤膜，放入增菌培养基中,按相应控制菌的检查方法进行检查。4。4。5。3阳性对照：取1ml试验菌液（含菌10100CFU），加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。4.4.5。4阴性对照：取10ml稀释剂或缓冲液替代供试液，加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。4.4.5.5结果
18、判定:在3次独立的平行试验中，阳性对照组应检出试验菌，阴性菌对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，建立新的方法，并重新验证.4.4。5。6控制菌检查方法验证结果：第一次：控制菌名称样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品：供试品g(ml）,加稀释剂ml，制成1:供试液；取供试液ml，冲洗次数次，每膜 冲洗量ml。 非水溶性供试品：供试品 g（ml），加乳
19、化剂(名称 ；批号 ) g（ml），加稀释剂ml，制成1：供试液；取供试液ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量ml。 其它： 。 培养基名称培养时间培养起止时间菌落生长情况试验组阳性对照阴性对照结论检查人/日期复核人/日期第二次：控制菌名称样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品：供试品g(ml），加稀释剂ml,制成1:供试液；取供试液ml，冲洗次数次，每膜 冲洗量ml。 非水溶性供试品：供试品 g（ml）,加乳化剂（名称 ；批号 ） g（ml）,加稀释剂ml，制成1：供试液;取供试液ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量ml。 其它： 。
20、培养基名称培养时间培养起止时间菌落生长情况试验组阳性对照阴性对照结论检查人/日期复核人/日期第三次：控制菌名称样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪档min 水溶性供试品：供试品g（ml）,加稀释剂ml，制成1：供试液;取供试液ml,冲洗次数次，每膜 冲洗量ml。 非水溶性供试品：供试品 g（ml），加乳化剂（名称 ；批号 ） g（ml）,加稀释剂ml,制成1:供试液；取供试液ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量ml。 其它: 。 培养基名称培养时间培养起止时间菌落生长情况试验组阳性对照阴性对照结论检查人/日期复核人/日期4。4。6验证结论：根据上述验证
21、结果，总结出该品种的微生物限度检查方法如下:5。验证结果评价与建议你5。1验证结果评估与结论:按照验证方案的要求实施验证,并将验证过程记录在验证报告中.对微生物限度检查方法验证的数据进行分析，对验证的结果进行分析和评价，并建议日常监控的项目和周期。5.2验证会审 验证领导小组对验证实施的过程及结果进行分析和评价，做出确认结论。主要关注如下问题是否得到证明和解决：5.2。1验证过程是否有遗漏？5。2。2验证过程中对验证方案是否进行过修改？修改原因、依据是否充分?是否经批准？5。2.3验证记录是否完整?数据是否真实？5。2.4验证结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理?是否需要做进一步实验？5.4最终批准：本验证项目按照验证方案的步骤和要求实施验证后，由验证小组对验证的结果进行分析和评价，验证领导小组组长在验证小组分析和评价的基础上，批准验证是否合格，批准是否投入检验使用。
