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1、-16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1. 适用*围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。2. 方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上
2、编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrD
3、NA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。16SrDNA27F519R357F1115R926F1492R3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。3. 设备和材料1.1 器材移液器（1000L、200L 、100L、10L）；涡旋振荡器；Eppendorf Mi*Mate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基
4、因分析仪：AB3500、AB31301.2 试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； E*oSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5Sequencing Buffer；BigDye *Terminator Purification Kit；1.3 耗材移液器吸头：1000L、200L、10L；离心管：1.5mL、200L；Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro AmpTM Optical Adhesive Fi
5、lm；1.4 引物16SrDNA名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3500 bp左右反向引物519R5- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3第2部分正向引物357F5- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3750bp左右反向引物1115R5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3第3部分正向引物926F5- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3560 bp左右反向引物1492R5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3其中M=C:A, Y=C:
6、T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1序列比对测序反应产物纯化基因扩增核酸提取4. 操作流程5. 实验方法1.5 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100LPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10L上清液与490L ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20保存。1.6 基因扩增1.6.1 PCR反应体系试剂使用量（25L体系）模板DNA2L（10ng100ng）Taq酶(5U/L)0.2L10Taq Buffer(Mg2+)2.5L
7、dNTPs(各2.5mM)2L引物F(1M)5L引物R(1M)5LddH2O8.3L备注：DNA模板量通常在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却35min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。1.6.2 PCR反应条件94：10min94：30s30Cyc58：30s72：45s72：5min 4：1.6.3 电泳称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳
8、结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。1.7 产物纯化1.7.1 每5LPCR产物加入2L E*oSAP-IT试剂，混匀。1.7.2 放入PCR仪中，37温育15min, 80温育15min。1.7.3 纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。1.8 测序反应1.8.1 测序反应体系试剂使用量（10L体系）模板DNA1L引物 (1M)1.6LBigDye Terminator1L5Sequencing Buffer1LddH2O5.4L1.8.2 测序反应条件96：2min96：30s30Cyc55：15s60：4min 4：1.8.3 测序反应纯化(BigDye *Term
9、inator Purification Kit)5.4.3.1每管加入27L SAM Solution和6LBigDye *TerminatorSolution。5.4.3.2放在Eppendorf Mi*Mate 上2000rpm震荡30min。5.4.3.3在离心机上以1000g离心2min。5.4.3.4每管吸取10L上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。1.9 序列比对基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。6. 关键说明1.1 提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑取一菌环菌株，置于100L ddH2O 中，混
10、匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50倍后做为PCR模板。必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。1.2 PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后置于低温冰箱中冷却35min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。1.3 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。具体参照附录。PCR出
11、现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。
12、减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。模板浓度过高10ul体系100ngDNA. z.-附录（资料性附录）1. 细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图321M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM：DL2000；1：引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）2：引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）3：引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp）. z.-2. 细菌16SrDNA鉴定结果1.1 16SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息：菌株TL140924的鉴定结果. z.-1.2 16SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息：菌株70528的鉴定结果1.3 16SrDNA的全序列信息：菌株70528的鉴定结果如附录2.2、2.3所示，当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。. z.
