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1、链霉素发酵工艺验证方案1. 目时确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备的发酵液能否到达中间体规格规定。2. 范围：此方案包括一种50吨大罐链霉素发酵液的（生产过程。2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原斜面2.2.2代一代2斜面2.2.3母瓶2.2.4子瓶2.2.5小小罐2.2.6小罐2.2.7中罐2. 2.8大罐2.3验证环节：确定验证方案，确定验证计划，内容、环节，以便精确验证链霉素发酵系统。3. 验证措施概要：3. 1生产记录：原斜面：冷藏期WlO天外观无菌外观集落：白色丰
2、满、正常代I或代2斜面：冷藏期W14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时21700uml效价96小时23500uml效价120小时N6700uml冷藏期W5天菌龄5064小时菌丝II-III子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时N7000uml效价144小时27500uml冷藏期W7天菌龄30-44小时小小罐：菌丝II-III镜检无菌放罐效价2800uml,残CW3.5g100ml,残N140mg/IoOmLPH7.5小罐：菌丝nIII镜检无菌放罐效价21200uml,残C3.5g100mL残NW
3、140mg/100mLPH7.5中罐：菌丝IIIII镜检无菌放罐效价21800uml,残C3.5gIoomI,残NW140mg/IOom1,PH7.5大罐：放罐残糖2.0克/100毫升放罐残氮W120毫克/100毫升放罐透光度240%放罐效价214000uml3.2 原材料：生产过程中所用的多种原材料及其规格(见原材料一览表)3.3 设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。3.4 以上所及设备的每一部分，必须在本次验证前保证通过合适鉴定(IQ/OQ),并且任何有关的测试装置通过校正。3.5 人员培训，作为验证研究日勺一部分，波及生产链霉素发酵的每位职工均经GMP及有关岗位SOP培训。4. 生产程
4、序和流程表：4.2 生产过程的描述：4.2.1 我厂用于生物合成链霉素日勺生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种日勺生命活力和稳定性，将他子保留于干燥的沙土内冷藏在24C冰库内，或者将抱子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于196液氮中。每年对生产菌株进行两次自然分离，控制菌落变异率5%,并进行菌丝八代遗传稳定性考察，考察其母、子代谢及效价单位的稳定性。挖取清洁海滩细沙（不能污染多种有机物），用自来水漂洗清洁，洗至漂出来的水澄清不浑浊为止，烘干、100目筛子过筛，用磁铁充足吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土（不能污染多种有机物），用自来水充足漂洗消毒，洗至漂出来的水澄清为止，烘干，120目筛子过筛
5、,用磁铁充足吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装于玻璃试管（12X10Omm）,每支装1g,用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MPa,温度122,时间1小时，消毒后置电烘箱烘干，UO120、45小时，外表明批号、日期备用，使用前为保证无菌起见，应按以上规定再消毒烘干一次。取符合质量规定的胞子斜面一支，在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水Iml左右，用1#棒将表面抱子轻轻刮下（防止用力过重划破琼脂）摇匀，用ImI割头无菌吸管吸出，精确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1ml抱子液（加入时应注意将吸管伸至靠近沙土处，但
6、又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁）。塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空干燥器内（干燥器内放置氯化钙干燥剂）保持真空度SlOMPa,抽4支时维持抽干4小时，抽5支或以上时，抽干时间酌情增长，取出抽干的沙土抱子，敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封，放24冰库中保留备用。使用时采用干接法接种。抱子沙土管有效有效期为2年。市售新鲜牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115C117C,0.07MPa,1520分钟消毒。将空白安培管洗净烘干，塞好棉花，置于消毒锅内121C,60分钟，间隙灭菌三次，待用。取符合质量规定的抱子斜面一支，加入无菌脱脂牛奶5
7、IOm1,用2#棒轻轻将抱子刮下，用无菌吸管吸抱子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，振摇10分钟,然后用Iml无菌吸管将珠子瓶内的抱子牛奶悬浊液加入无菌安培管中，0.3ml支，做好标识存置于液氮中保留，寄存有效期5年。4.2.2 种子组洁净工作台洁净等级100级，每三个月对尘埃粒子（20.5u时尘埃W3.5粒/1L空气）、风速（20.35m/s）、无菌（定点启动双碟30分钟WI个/碟）进行测定。平时每次操作定点放置定点启动双碟30分钟，控制杂菌菌落Wl个/碟。每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消毒剂（1/600洁尔灭、75%酒精）。4.2.3 抱子斜面：取生产用之抱子沙土管或抱子冷冻管在无菌室内，用
8、操作棒勺取适量抱子接种于斜面培养基上，尽量将狗子涂开使长单个集落，然后于27士恒温室内培养6-7天，该生长成之抱子斜面称为原斜面，仅作胞子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻泡子接出原斜面。根据质量状况可酌量考虑制作母瓶，有效有效期在24C冷藏中不超过10天。斜面外观除了个别不正常集落以外，应大部份为白色，丰满梅花型，馒头型、圆型之集落，将原斜面抱子，挑选23只正常集落点种第一代，用第一代传代斜面同样点种第二代传代斜面，第一第二代他子斜面，培养条件均为271C恒温室内培养67天，第一、第二代斜面有效有效期为14天，均可制作母瓶，狗子斜面传到第二代为止，不再传第三代，挖块制作过母瓶之剩余抱子斜面，应
9、保留在冷藏库中一种月，以备检用。斜面培养基配制法:名称配比%葡萄糖（注射用）0.81.2蛋白陈0.3-0.6氯化钠0.40.6豌豆浸出液12-16琼脂（海燕牌）2.02.8PH7.07.4消后规格:C(g100ml)N(mg100ml)32-38P(ugml)60-90PH豌豆浸出液制备：豌豆：30克氯仿：0.5%（二次）自来水：加至100OmlIMH2SO4:调PH用将30克豌豆洗净沥干，加入100Oml自来水，用IMH2SO4,调PH至4.24.5,力口0.5%氯仿、盖上磨砂瓶塞，振荡摇匀后，放出气体，再盖紧放置于37恒温室一昼夜取出，再用1MH2SO4调整PH值维持在424.5,力口0.
10、5%氯仿摇匀、盖紧放371恒温室6天，粗滤除去豌豆，滤液分盛于开口的搪瓷杯中，置沸水浴中，煮沸20分钟（清除氯仿）冷却，用滤纸过滤，清除沉淀的蛋白质、分装于750ml摇瓶中，每瓶装量约20OmI左右，以0.09Mpa、118120CB条件消毒20分钟，冷却后放入冰箱中备用。同步抽样送化验，检查质量，在使用该批豌豆浸出液时，必须再送一次样品，测定氨氮含量与第一次相靠近时可按后一次样含量计算使用，如第二次含量与第一次不符，须再抽样复试，以最终一次化验数据为准进行计算使用。豌豆浸出液质量:项目规格外观澄清液氨氮(NH2-N)170-200mg100ml磷（PO4）600ug100ml左右无菌状况无杂
11、菌4.2.4 母瓶：用符合质量原则的同支抱子斜面（冷藏期不超过14天）在无菌室内用挖块法分别将抱子接种到已准备好之二只摇瓶中，编号为母I母II,接种后送至温度271C恒温摇瓶间内，在23020r/mm摇瓶机上,培养5064小时，菌丝阶段II一IH初之母I用牛皮纸包扎寄存于24。C冷库中，母11继续培养作质量检查，做无菌试验二支，分别进行27C及37C培养。68小时取样分别测定单位粘度，氨氮消耗、PH、u/ml,后来每24小时取一次样测定上述项目,合计三次（68小时，96小时，120小时三次）如母瓶质量符合规定，则母瓶可以进罐使用，母瓶有效冷藏期为5天。制得的母瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒、米
12、黄色、无异味不化稀无菌正常。效价：120小时26700uml接子瓶的母瓶制备法，用无菌操作挖一块斜面，接入一只母瓶，在摇瓶机上培养5064小时，取下，挑选外观正常菌丝粘稠，色泽米黄，无颗粒状菌丝日勺母瓶，作为接子瓶用，接种子瓶的I母瓶不冷藏。遇特殊状况，一般冷藏不超过5天。母瓶原材料及配例如下：原材料配比葡萄糖3.55.5黄豆饼粉3.04.5碳酸钙0.50.8硫酸镂0.50.8氯化钠0.25-0.5磷酸二氢钾0.04-0.07消后质量规格:C(gml)3.84.8N(mg100ml)130155P(ug100ml)130155取符合种子质量原则之母瓶，在无菌操作条件下，用吸管接入已准备好的子瓶
13、培养基中，每瓶接种量约3ml,瓶数按需而定（母瓶接子瓶前做无菌试验斜面二支，分别培养于27,37恒温室，母瓶接子瓶后,吸管做无菌试验斜面一支，在37C恒温室培养），接种后子瓶送271C恒温室培养3044小时，菌丝阶段在IIIn初，长好后，留五瓶继续培养，作质量分析，其中三瓶在120及144小时分别取样测定效价，一瓶测粘度及氨氮，一瓶接无菌斜面二支作无菌试验（分别培养于27,37C恒温室）及观测菌丝形态，（新菌株要加测C及PH）其他瓶冷藏于24冰库中备用有效冷藏期为7天，如在保留期间发既有化稀现象或有染菌嫌疑，即停止使用，改用其他批号种子，放摇瓶种子应同步准备有23批瓶存备用。制得的子瓶应菌丝稠
14、粘，目检无菌丝团颗粒，米黄色，无异味。不化稀（比母瓶厚）。效价：120小时N7000uml,144小时27500umh子瓶原材料及配例如下：原材料配比葡萄糖3.55.5黄豆饼粉2.3-3.5碳酸钙0.20.7硫酸核0.50.7氯化钠0-0.2磷酸二氢钾0.0450.07豆油IL玉米浆0-0.2消后质量规格:C(gml)6.04.8N(mg100ml)160-180P(ug100ml)1551804.2.5 小小罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫日勺更换检查严密度，检查部分包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌罐则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有无
15、培养基倒流。培养基实行实消：空消时预热至压力到达0.160.19MPa0排出罐内冷凝水后计空消时间为1545分钟，温度为125130C,空消时间到后压力跌OMPa进行投料实消。先加水至搅拌处，然后投入已配好的培养基，搅拌成匀浆状加热，打开各支路蒸汽，关闭罐盖待压力上升至0.07-0.12MPa时计时20分钟左右，消毒温度为115124C,结束后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH0小小罐采用摇瓶2-8瓶火焰接种，加空气流量至OJm3/分,5小时流量加至0.5m3分，一只小小罐种子可移入23只小罐作种子用。接后开始每4小时取无菌样，每8小时测PH和菌丝浓放罐测C和效价，25小时左右始每8
16、小时测N,种子罐移种原则菌丝呈II一In初阶段，无菌，接种前2小时须将种液涂片镜检什菌状况，培养条件：271,35030r/min,4668h,0.5r3分，若种子罐生长过程中遇代谢过快时可适时降温培养，遇代谢慢种子罐PH上升，可减少通气量，调整配方等工艺调整措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量规定。小小罐原材料及配例如下:原材料名称小小罐(120L)配比小小罐(50OL)配比葡萄糖3.55.5黄豆饼粉2.53.5硫酸铉O.50.7碳酸钙0.2-0.7磷酸二氢钾0.045-0.07玉米浆O.l0.2（机动）豆油1L/罐批氯化钠O.l0.2配料体积100L250L消后体积100L250L消后规
17、格如下PH消后C消后N消后P小小罐6.08.O2.84.4115170120200小小罐控制规格：(I)消后CNP必须符合质量规定，若不符合则重新投料、消毒。(2)中间控制温度必须在271C,超过30时间较长则不能作为种子。(3)染菌罐不能作种子用。(4)氨氮在中间代谢中必须逐渐运用，若后期回升则不作种子用。(5)放罐控制：残糖3.5g100mL残氮W140mgIoomLPH7.5,效价280OU/mlo(6)菌龄必须以控制菌丝阶段1111I初为主。(7)接种量母瓶必须2瓶以上，子瓶3瓶以上。4.2.6 小罐:在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫时更换，检查严密度，检查部分包括空气
18、分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有无培养基倒流。培养基实行连消：经清洗，检查严密后的罐批方可进行空消，空消时罐予热至压力到达0.16-0.19MPa时，排出罐内冷凝水后再开始计算空消时间，一般为4045分钟，温度为125130C之间，待空罐消毒罐压维持在0.08-0.IMPa时导入无菌空气保压，即可进入连消状态。连消时总蒸汽压力不低于0.25MPa,按生产进度把各类罐空消完毕，同步各所用管路也必须经蒸汽消毒，压力0.20.25MPa,45分钟后可进入连消连消时通过泵把培养基输入消毒维持罐,连消条件为0.2MPa,126135、56吨/
19、h。消入罐中，冷却培养基至近培养温度，保压待接种，取消后样测C、N、P、PHo培养基实行实消：空消时预热至压力到达0.160.19MPa0排出罐内冷凝水后计空消时间为1545分钟，温度为125130C,空消时间到后压力跌OMPa进行投料实消。则先加水至搅拌处，然后投入已配好的培养基，搅拌成匀浆状加热。打开各支路蒸汽，关闭罐盖待压力上升至0.070.12MPa时计时2025分钟，消毒温度为115124C,结束后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PHo小罐可用摇瓶火焰接种，68瓶或小小罐种子移入种子，或小罐移入种子，接种后加流量至（Un?/分，5小时后来流量加至InP/分，一只小罐种子一般移
20、入一只中罐，特殊状况时一只小罐种子可移入二只中罐。接后开始每4小时取无菌样，每8小时测PH和菌丝浓放罐测C和效价，25小时左右始每8小时测N,种子罐移种原则菌丝呈11In初阶段，无菌，接种前2小时须将种液涂片镜检什菌状况，培养条件：27C,33020r/min,4060h,Im3/分。若种子罐生长过程中遇代谢过快时可适时降温培养，遇代谢慢种子罐PH上升，可减少通气量，调整配方等工艺调整措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量规定。小罐原材料及配例如下:原材料名称小罐(50OL)配比葡萄糖4.55.5黄豆饼粉2.5-3.5硫酸铁0.50.7碳酸钙0.2-0.7磷酸二氢钾0.05-0.07玉米浆0.
21、10.2（机动）豆油1L/罐批氯化钠0.10.2配料体积250L消后体积250L消后质量规格如下:PH消后C消后N消后P小罐6.08.03.55.5120180130190接后体积200-300L小罐控制规格：(1)消后CNP必须符合质量规定，若不符合(指差距较大)；在接种前必须纠正。(2)中间控制温度必须在271。(3)染菌罐不能作种子用。(4)放罐控制：残糖W3.5gIoomL残氮W140mgIoomLPH7.5,效价21200uml.(5)菌龄必须以控制菌丝阶段1111I初为主，一般在4048小时。(6)中间代谢中，氨氮必须逐渐运用。(7) 一只小小罐最佳接2只小罐。(8) 一只小小罐可
22、所有接入中罐作种子用。4.1.7 中罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫日勺更换，检查严密度，检查部分包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌罐则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有无培养基倒流。培养基实行连消：经清洗，检查严密后的罐批方可进行空消，空消时罐予热至压力到达0.160.19MPa时，排出罐内冷凝水后再开始计算空消时间，一般为4045分钟，温度为125130C之间，待空罐消毒罐压维持在0.08-0.IMPa时导入无菌空气保压，即可进入连消状态。连消时总蒸汽压力不低于0.25MPa,按生产进度把各类罐空消完毕,同步各所用管路也必须经蒸汽消毒，压
23、力0.20.25MPa,45分钟后可进入连消，连消时通过泵把培养基输入消毒维持罐，连消条件为0.2MPa,126135、56吨h0消入罐中，冷却培养基至近培养温度，保压待接种，取消后样测C、N、P、PHo中罐由小罐移入种子（或整只小小罐移入），开始加空气流量，前5小时微量，后来逐渐递加流量至360m3h,每二只中罐可移入一只大罐。各级罐压出种子前均先用被接种罐内培养基压到压出罐接种管进行冷却管道，防止烫伤种子。接后开始每4小时取无菌样，每8小时测PH和菌丝浓放罐测C和效价，25小时左右始每8小时测N,种子罐移种原则菌丝呈1111I初阶段，无菌，接种前2小时须将种子液涂片镜检什菌状况。培养条件：
24、271,18020r/min,3560h,6r3分，若种子罐生长过程中遇代谢过快时可适时降温培养，遇代谢慢种子罐PH上升，可减少通气量，调整配方等工艺调整措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量规定。中罐原材料及配例如下表：原材料配比%葡萄糖4.55.5黄豆饼粉2.53.5硫酸镂O.50.7氯化钠O.l02（机动）碳酸钙O.20.7玉米浆O.l0.2（机动）豆油8L/罐硫酸二氢钾0.05-0.07配料体积3.23.5M3消后体积3.03.2M3消后质量规格如下:PH消后C(g100mD消后N(mg100ml)消后P(rl)6.0-8.03.55.5120180130190接后体积2.53.5M3
25、中罐控制规格：(1)消后CNP必须符合质量规定，若不符合(指差距较大)在接种前必须采用措施纠正。(2)中间控制温度必须在271C,超过30C时间较长则不能作为种子用。(3)染菌罐不能作种子用。(4)氨氮在中间代谢中必须逐渐运用。(5)菌龄必须以控制菌丝阶段1111I初为主，一般在3050小时。(6)接种量一只小罐接一只中罐，或一只小小罐可接一只中罐。(7)放罐控制：残糖W3.5g100mL残氮140mgIoOmLPH7.5,效价21800umlO(8)小小罐、小罐、中罐碰到氨氮消耗快时可将罐温调整到260.5培养。4.1.8 大罐：4.1.8.1 大罐放罐后，降罐压至零磅，开盖用水冲洗，将冲洗
26、后的残留发酵液,压入提炼承接桶内，再打开罐盖，进罐内清除积垢后，检查搅拌，空气分布管，叶子及上下婆司与否松，同步进行阀垫及填料的更换和检修工作。然后盖好罐盖，通入空气，进行各连接处法兰等、阀门、配根、罐盖、氨水、空气等严密度检查。待检查完毕后，盖紧罐盖、准备下次空罐消毒。如遇染菌，可下去敲铲，清除积垢，空消时延长消毒30分钟。罐空消：依次打开罐日勺各路蒸汽，加热至压力0.160.19MPa进行压水后进行消毒45分钟，结束后导入无菌空气至0.08-0.IMPa保压，若上一罐批染菌，则金属过滤器进行消毒。发酵罐培养基消毒：发酵罐采用连消法消毒培养基，总蒸汽压力不低于0.3MPa,用泵将已配制的氮源
27、（饼粉等）碳源（糖水）依次分别进入消毒塔、维持罐消入发酵罐,维持罐压力为0.2MPa维持时间5分种（残存料维持8分钟）。控制消毒塔温度在128133,流速控制在每小时1012吨。先消饼粉，后消糖水，两者可间隔消2吨自来水，最终可酌情消入自来水补足体积。发酵罐原材料及配例如下：原材料配比黄豆饼粉1.82.2葡萄糖4.06.0硫酸镂0.20.7氯化钠0-0.2碳酸钙0.20.7磷酸二氢钾0.060.09豆油10-30L玉米浆0.10.2氯化钻0.2配料体积34-40M3消后体积25-37M3消后质量规格如下:PH消后C(g100ml)消后N(mg100ml)消后P(rml)不小于6.24.56.5
28、130-160200-260接后体积3040M3罐内培养基的接受:当培养基进入维持罐内78分钟后,告知关罐进气及开排气阀，控制罐压0.04-0.06MPa,启动入罐阀接入培养基，当培养基碰到蛇形管、即开冷却水冷去队当接料完毕，关闭入罐阀，进空气，保持罐压0.08-0.09MPa,待温度冷至29准备接种。消后测PH规定6.2以上，如低则加NaOH调整。接种前、接种后取样测C、N、P、PH并做无菌测验。4.182发酵罐（大罐）接种和培养，发酵工艺。发酵罐接种：先提高中罐或倒种罐罐压，在0.1MPa以上，保持发酵罐之接种罐罐压为0.030.05MPa,打开接种入罐阀，种子罐（中罐或倒出发酵罐）菌液借
29、压力差流入发酵大罐内，接完后关罐入罐阀，开入适量空气流量在IOm3/分以上，保持罐压0.05-0.06MPa,温度29开始培养。发酵罐在接入种子前应先将罐内培养基压到压出种子罐接种管道进行管道冷却，防止烫伤种子。4.1.8.3发酵罐培养和工艺接种：发酵大罐由23只中罐接种一只大罐，也可由48110hr菌龄的发酵罐作种子接入一只大罐，种子体积在35t。各级罐压出种子前均先用被接种罐罐内培养基压到接种罐进行冷却管道，防止烫伤种子。种子罐移种原则菌丝呈II-III初阶段，无菌，接种前2小时须将种液涂片镜检什菌状况.培养条件罐温：大罐罐温在2630C,一般控制在29,罐温测定用电阻温度计量来控制罐温，
30、前期代谢速度快可降温2527C培养，后期代谢慢的罐批可提高至30C培养数小时至放罐。罐压：大罐罐压在0.02-0.05Mpao空气流量：大罐接种后开空气流量在IOm3/分以上，不开搅拌，后来逐层增长流量2530m3/分，进入总过滤器前，空气温度4555。如遇发酵后期反应剧烈，可合适减少空气流量和提高罐压。搅拌转速：大罐正常转速在IlO120rmin,亦可根据生长代谢进行调速。前期罐按菌丝生长速度间歇开搅拌，菌丝浓度长至70%时，搅拌全开，中后期搅拌全开。培养时间：大罐培养时间为16010小时。中间取样：大罐接后每8小时取无菌斜面2支、肉汤1支，每4小时测氨氮与pH,培养周期至20100小时每8
31、小时测残糖，100小时后每24小时测残糖，培养至40小时左右时每8小时测化学效价。放罐质量:残糖2.0g100m1,残氮W120mgIoOm1,PH8.2,效价214000uml,透光度240%。发酵大罐中间控制消沫：前期或后期发酵剧烈时可少许多次加油，中期由于补糖量增长液面升高也可酌情加油，若加油无效可放提炼若干吨。补糖：补糖根据发酵液中残糖补入,从大罐培养3050小时可补第一次糖水、糖水浓度控制4060%,每隔2030小时补一次，共补46次，遇反常罐可酌情减量补入。第一次控制残糖含量局限性部份添加至4.85.2%第二次控制残糖含量4.85.0%4. 0-4. 5%第三次控制残糖含量第四次控
32、制残糖含量2. 52. 8%第五次控制残糖含量L72.0%尤其状况一次补糖量3.0%时以分二次补入为宜，第三、四、五次补糖按培养时间及放罐残糖控制0.5%如下计算补入量，若糖耗慢的罐批则第五次糖可以不补。后期控制补糖量应与氮耗相调，防止发酵液化稀。补氮：补氮可用15%的无菌过滤氨水或(NHD2SO来调整。通氨原则：(1)根据残氮用量计算通氨量。(2)参照控氮水平。(3)参照代谢及浓度。培养到2040小时根据氨氮运用计算通氨量，并加氨水以调高发酵液pH,每隔4小时添加一次，补量W351/次，若超351可分次补入，每次通氨为流加，生长期最适PH为6.56.9,氨氮水平可在90120mg/100ml
33、,培养40小时菌丝进入分泌期,此时最适PH控制在6.87.2,控氮水平80水Olng/100ml,若PH超7.10可以合适加(NH4)2SO4替代氨水，以调低pH,(NH4)2S040.l%20mg/100mlNH2-N)o硫酸氨控制补入量V0.1%,尽量在140小时前补入，120小时到放罐合适将氨氮控制在7585mg/100ml,若120小时后NH2-N超过90mg/100ml,则可降温至25,若状况严重菌丝化稀可冷却，发酵周期为160土10小时。大罐控制质量：(1)消后C、N、P、PH必须符合质量规定。假如PH不不小于6.2,则用NaOH调整至不小于6.2。假如P局限性在接后24hr之内再
34、补足，接后每公斤磷酸二氢钾按提高发酵液6g/ml来补充，一般至少要补硫酸二氢钾3千克。一般最佳接种形式：以三只中罐接一只大罐或者两只中罐加48-IlOhr菌龄日勺发酵大罐倒种(即双中加大倒)。遇特殊状况，如中罐生长不良或者染菌，也可采用大倒或者单中加大倒形式。大罐倒种要注意菌丝传代次数。菌丝传代次数以摇并种子菌丝作第一代计算起。根据不一样接种形式，接消后体积见下表。三中双中双中十大倒单中十大倒大倒消后体积(M3)24-2927-3325-3127-3429-37配料体积(M3)30-4034-4034-4034-4032-40接后体积(M3)34403440344034403240(3)放罐铁
35、含量在50rml以上，必须去铁涂油。4.2、生产过程流程图:(参见流程图)1.2 生产链霉素发酵液一关键中间体参数:1.3 最终发酵液关键参数:参数测试仪器或措施接受原则无菌状况当班片及无菌斜面镜检无菌放罐残糖碘量法2.0克/100毫升放罐残氮甲醛法120亳克/100亳升效价化学效价法14000um放罐透光度44号滤光板240%放罐PHPH计测试8.26. 验证汇报发酵大罐前24h左右运转期间为菌丝生长时期，放罐前12h左右为菌丝衰融期，对其30h始至周期14Oh间的培养温度、空气流量、罐压、PH进行统一专门控制并进行记录，算出每一控制项的平均值X、偏差3及,控制w5.0%,若有超过此范围肛及
36、时予以纠正跟踪。7. 所及记录计算公式：放罐体积=放罐视体积M3X泡沫系数（）（M3）放罐总亿二放罐生物效价u/mlX放罐体积（M3）X10-2亿对大罐中期pH、流量、罐压、温度记录计算中：8. 变化控制：假如有关生产过程、设备、原材料规格等发生变化在上述SoP中的变化控制体系也将被认证，并将变化部分形成文献，交QA同意通过，其中包括由于变化引起的有关附加认证日勺成果。9. 再认证：无论何时发生如8节讨论的变化，必须对此生产过程进行再验证。如若失败，须查出原因，并采用合适措施，并在附加过程验证时对此进行必要的评估。10. 验证周期：以上验证工作每两年一次。11. 验证日期：本次验证日期为2023年3-2023年4月。12. 验证人员：发酵工艺员：张立弦发酵种子组、工艺组、消检配组、值班组操作人员。
