《TGXAS-海水类固醇激素的测定的测定高效液相色谱-串联质谱法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TGXAS-海水类固醇激素的测定的测定高效液相色谱-串联质谱法.docx（16页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。
1、ICS71.040.40CCSZ10T/GXAS体标准TGXASXXXXXXXX海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法SeawaterDeterminationofsteroidhormonesSolidphaseextraction-HighperformanceIiquidchromatographymassSpectrometricmethod（征求意见稿）XXXX- XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14方法原理15干扰和消除16试剂和材料17仪器和设备28样品29分析步骤310结果计算及表示511精密度和
2、准确度712质量保证和质量控制713固体废物处置8附录A（规范性）方法检出限和测定下限9附录B（规范性）精密度和正确度1三,/1刖百本文件参照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西环境科学学会提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区海洋环境监测中心站、广西壮族自治区北海生态环境监测中心、上海第二工业大学、广东海洋大学、广西壮族自治区钦州生态环境监测中心、广西蓝合创讯数据科技有限公司。本文件主要起草人：任朝兴、蓝文陆、韦业、高桂兰、龙慧琴、王其春、吴鑫、房
3、琴、苏子幸、张文武、王永峰、廖丽、赵利容、张膨、张际标、黄仕英、吴茂银。海水类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法警示：实验中使用的溶剂和试剂均具有一定的毒性，对健康具有潜在的危害，应尽量避免与这些化学品直接接触。试剂配制和样品前处理过程应在通风橱内进行，操作时应按要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。1范围本文件规定了测定海水中类固醇激素的高效液相色谱-串联质谱法。本文件适用于海洋生物体中的雄激素（诺龙、表睾酮、甲睾酮、雄烯二酮）、孕激素（孕酮、快诺酮、甲羟孕酮、甲地孕酮）、糖皮质激素（可的松、氧化可的松、地塞米松）和雌激素（雌酮、17-雌二醇、17B-雌二醇、雌三醇）等15种类固醇激素的
4、测定，其他类固醇激素经适用性验证可参照执行。当富集样品体积为100Oml,浓缩后定容体积为1.0mL,进样体积为5.0L时,方法检出限为1.6ng/L3.9ng/L,测定下限为6.4ng/L15.6ng/L,详见附录Ao2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB17378.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输HJ442.3近岸海域环境监测技术规范第三部分近岸海域水质监测3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理采用固相萃取样品前处理方法，用
5、高效液相色谱一三重四极杆串联质谱仪（LC-MS/MS）检测海水中的类固醇激素化合物，按多反应监测（MRM）方式，根据保留时间和特征离子定性，内标法定量。5干扰和消除当样品中存在基质干扰时，可通过优化色谱条件、稀释样品、减少进样体积以及对样品进行预处理等方式降低或消除。当样品中存在同分异构体干扰测定时，可通过改变色谱条件提高分离度或选择不同的二级质谱子离子消除干扰。6试剂和材料61实验用水，GB/T6682,一级。69乙酸乙酯（CH3COOCH2CH3）,色谱纯。A1甲醇（C0H）,色谱纯。A4氨水（NH3H2O）,优级纯。A4乙酸乙酯/甲醇混合溶液：1：1（体积比）。66甲酸（HCOOH）：P
6、（HCOOH）=1.22gmL,优级纯。A7甲酸溶液：1：1000（体积比）。取ImL甲酸（6.6）加入IoOOmL水中。AA类固醇激素标准贮备液：P=IoOmg/L。可直接购买有证标准溶液，也可用固体标准物质制备。用甲醇（6.3）溶解并稀释至100mg/L（参考浓度）。贮备液在-20C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。A。类固醇激素标准使用液：P=LOmg/L。将类固醇激素标准贮备液（6.8）用甲醇（6.3）稀释至1.0mg/L（参考浓度）。现配现用。A1fl内标储备液：P=100mg/Lo采用睾酮Y3、孕酮-4、氨化可的松-1,2-4、雌三醇-ds内标参照。应
7、采用有证标准溶液或标准物质制备内标储备液，用甲醇（6.3）溶解并稀释至IoOnIg/L（参考浓度）。在-20C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。611内标使用液：Q=LOmg/L将内标储备液（6.10）用甲醇（6.3）稀释至1.0mgL（参考浓度）。现配现用。A10针式过滤器：滤膜为0.22Mm尼龙或聚四氨乙烯材质。6 11滤膜：0.7Pm玻璃纤维滤膜，或相当者。A14氮气：纯度299.999做7仪器和设备7 1采样瓶：1000mL棕色螺口玻璃瓶，瓶盖具聚四氟乙烯内垫。70液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ESI）,具备流动相梯度洗脱和质谱多反应监测功能。7
8、1色谱柱：C8反相高效液相色谱柱。1.7m,50m2.1mm（内径）或其他等效色谱柱。74固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。74固相萃取柱：HLB柱,填料为二乙烯苯和N-乙烯基毗咯烷酮共聚物或等效萃取柱,规格为6mL/200mgo76浓缩装置：旋转蒸发装置或K-D浓缩器、氮吹浓缩仪等性能相当的设备。77微量注射器或移液枪：10双、100MU1mL、5mL7A分析天平：感量0.01go7。泯旋混匀器。7. 1f一般实验室常用仪器和设备。8样品ft1样品采集与保存按照GB17378.3和HJ442.3的相关规定采集样品。用预先洗涤干净并烘干燥的采样瓶（7.1）采集水样。样品采集后在4C以下避光
9、保存，7d内完成样品前处理。R1试样制备8. 2.1试样预处理水样采用凝膜（6.13）过滤后，按&2.2步骤进行固相萃取。9. 2.2固相萃取法分别用IOnlL乙酸乙酯/甲醉混合液（6.5）、甲醇（6.3）和实验用水以IInLmin流速活化固相萃取柱（7.5）,在活化过程中应确保小柱中填料表面不露出液面。量取IoOOmL海水样，水样以约IOmLmin的流速通过固相萃取柱，若水样中目标物浓度较高，可根据实际情况减少样品体积。再用10InL水淋洗小柱，去除杂质，用氮气（6.14）吹干小柱。用10mL乙酸乙酯/甲醇混合溶液（6.5）以1mL/min流速洗脱富集后的小柱，收集洗脱液。用浓缩装置（7.6
10、）将上述洗脱液浓缩至LOmL以下，用甲醇（6.3）定容至1.0mL,加入50UL内标物使用液（6.11）,使用涡旋混匀器（7.9）混匀后用针式过滤器过渡（6.12）,置于棕色进样瓶中，待测。R1空白试样的制备10. 3.1实验室空白以实验用水代替样品，按照与试样的制备（8.2）相同操作步骤，进行实验室空白试样的制备。11. 3.2全程序空白采样前按照样品采集和样品保存（8.1）方法，以实验用水代替样品，在采样现场制备全程序空白样品。9分析步骤12. 1仪器调试9.1.1 液相色谱条件9.1.1.1 流动相：流动相A甲酸溶液（6.7）,流动相B甲醇（6.3）,梯度洗脱程序见表1和表2；9.1.1
11、.2 流速：0.2mL/min；9.1.1.3柱温：40；9.1.1.4进样体积：5.0Lo9.1.2质谱条件9.1.2.1电喷雾离子源（ESI）,雌激素采用负离子模式，雄激素、孕激素、糖皮质激素采用正离子模式；9.1.2.2毛细管电压:4.0kV；9.1.2.3干燥气温度：350；9.1.2.4干燥气流速：11L/min；9.1.2.5雾化气气压：1.72IO5Pa（25psi）o9.1.2.6多离子反应监测方式（MRM）,具体条件见表3。表1液相色谱流动相梯度洗脱程序（雄激素、孕激素和糖皮质激素）时间(min)流动相A（%）流动相B（%）095100.595107.559511.05951
12、1.195512.5955表2液相色谱流动相梯度洗脱程序（雌激素）时间(min)流动相A（%）流动相B（%）090101901034555445558307095951059510.19010129010表3目标化合物的多离子反应监测条件化合物名称母离子m/z子离子m/z驻留时间S锥孔电压V碰撞能eV雄激索诺龙(Nondrolone)275.2109.1*4.723525257.33510雄烯二酮(Androstensdione)287.396.84.754024108.9*4023表睾酮(Epitestosterone)289.496.9*5.303525108.93527睾-DS(Test
13、osterone-D3)292.397.0*4.923020109.03025甲睾酮(17-Methyltestosterone)303.297.25.203323109.2*3323孕激素快诺酮(Norethindrone)299.2109.1*4.793827231.13820孕酮(Progesterone)315.297.1*5.612823297.12816孕酮-Dg(Progesterone-D9)324.4100.2*5.582820113.12820甲地孕酮(Megetrol)343.397.0*5.282525224.02525甲羟孕酮(Mcdroxyprogesterone)
14、345.297.1*5.452626123.22624糖皮质激素可的松(Cortisone)359.2121.03.953027163.1*3025氢化可的松(Hydrocortisone)363.2309.24.113014327.2*3015氢化可的松-1,2-d2(Cortisone-1,2-d2)365.1311.24.093014329.2*3014地塞米松(Dexamethason)393.2355.2*4.453010373.23011雌激素雌酮(Estrone)269.2142.94.023048144.9*303617-a雌二醇(17-alpha-Estradiol)271.
15、2144.9*4.143040239.2303917B-雌二醇(17-beat-Estradiol)271.1144.9*4.003040182.93036雌三醇(Estriol)287.2145.03.183039171.0*303717a-乙快雌二醇(ITa-Ethinylestradiol)295.2145.1*4.034538159.14535雌三醇Tj(Estriol-D3)290.2147.0*3.172540173.02531注：带*的为定量离子，对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前将质谱参数优化到最佳。95校准曲线绘制9.2.1取一定量类固醉激素标准使用液（6.9）,制备
16、至少5个浓度点的标准系列，质量浓度分别为0.5gL1.0gL2.0gL5.0gL10.0gL2050Mg/L、100gL,贮存在棕色进样瓶中，校准曲线应临用现配。9.2.2在仪器最佳工作条件下，按照浓度从低到高的顺序上机测定，以目标组分的峰面积为纵坐标，标准系列溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。4试样测定取待测试样（8.2）按照与绘制校准曲线相同的仪器分析条件进行测定。94空白试验按照与试样测定（9.3）相同的操作步骤进行空白试样（8.3）的测定。10结果计算及表示1定性分析在相同的实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在2.5%之内；每种化合物的质谱定性离子至少应包括一个
17、母离子和两个子离子,且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表4规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度KK5020K5010 I i I I j f I I I I I . . . . I . I . . I I .5.036.7008.009 00100011 001 2 004 14TIC (17-alpha-Estradiol)5: MRM of 3 Channels ES-900100011 00 Time2bo14.b,16o,8.6(),io,66,i2,66,
18、i4l66,ieoo,s662l0,122,66,图1类固醇激素的MRM色谱图（续）1结果表示测定结果小数点后位数的保留与方法检出限一致，最多保留三位有效数字。11精密度和准确度见附录B。12质量保证和质量控制O1空白分析12.1.1 每次分析至少做1个试剂空白和实验室空白。12.1.2 全程序空白应每批样品做1个，前处理条件或试剂变化时均应重新做全程序空白。各类空白中检出每个目标化合物的浓度不应超过方法检出限。19）平行样的测定每20个样品或每批次（少于20个样品/批）至少分析1个平行样，平行样相对偏差W30%。“1基体加标每20个样品或每批次（少于20个样品/批）至少分析1个基体加标样。加
19、标回收率应在50%130%.O4校准12.4.1初始校准在初次使用仪器，或在仪器维修、更换色谱柱或连续校准不合格时应进行初始校推。即建立标准曲线，校准曲线的相关系数20.995,否则重新绘制校准曲线。12.4.2连续校准用分析校准曲线的中间浓度点进行连续校准，每20个样品或每批次（少于20个样品/批）分析1次连续校准。按公式（2）计算a与校准点C的相对偏差（D）：O=詈XlO0%（5）式中：DCC与校准点Ci的相对偏差，%;Q校准点的质量浓度的数值，单位为微克每升（ug/L）；CC测定的该校准点的质量浓度的数值，单位为微克每升（PgL）o如果D20%,则初始标准曲线仍能继续使用；如果任何一个化
20、合物的D20%,应重新绘制新的标准曲线。13固体废物处置H1实验过程中所有使用过的标准物质不应随意倾倒，应专门留存，交由有处理资质的有机废物处理公司进行处理。H3实验操作过程产生的有机溶剂废液，应交由有处理资质的有机废物处理公司进行处理。附录A（规范性）方法检出限和测定下限表A.1给出了本方法中目标化合物的检出限和测定下限。表A.1方法的检出限和测定下限序号化合物名称CAS号检出限ng/L测定下限ng/L1诺龙(Nondrolone)434-22-02.08.02雄烯二胡(Androstensdione)63-05-82.28.83表睾酮(Epitestosterone)481-30-12.7
21、10.84甲睾酮(17-Methyltestosterone)58-18-42.39.25烘诺酮(Norethindrone)68-22-42.710.86孕丽(Progesterone)57-83-02.18.47甲地孕阴(Megetrol)3562-63-82.510.08甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)520-85-42.510.09可的松(Cortisone)53-06-51.97.610氢化可的松(IIydrocortisone)50-23-73.915.611地塞米松(Dexamethason)50-02-22.510.012雌阳Estrone53-16-71.9
22、7.61317-雌二醇(17-alpha-Estradiol)57-91-01.66.41417B-雌二醇(17-beat-Estradiol)50-28-21.76.815雌三醇(Estriol)50-27-11.87.2附录B（规范性）精密度和正确度表B.1规定了方法重复性、再现性等精密度指标。表B.2规定了方法正确度指标。表B.1方法的精密度化合物名称精密度统计结果加标浓度11gL总均值ng/L实验室内相对标准偏差%实验室间相对标准偏差%重复性限（r）ng/L再现性限（R）ng/L诺龙(Nondrolone)107.44.2%8.5%18.41.54.12017.23.86.8%20.2
23、2.99.95042.82.96.4%24.46.429.8雄烯二酮(Androstensdione)108.65.98.5%9.11.74.12017.84.373.4%12.84.39.95049.42.3-13.1%9.810.629.8表睾酮(Epitestosterone)107.53.47.6%4.91.01.42018.53.75.5%18.12.29.65044.63.67.7%17.27.122.5甲睾酮(17-MethyItestosterone)108.12.1-5.2%17.90.94.22014.0L55.3%15.41.76.25037.91.39.0%7.56.3
24、9.8快诺酎(Norethindrone)108.43.96.5%28.41.36.32015.82.66.6%25.32.311.65040.81.99.0%23.98.128.4孕酮(Progesterone)108.53.6-13.6%20.52.15.22015.92.05.5%19.91.79.05041.42.14.7%20.43.823.7甲地孕酮(Megetrol)109.13.38.6%23.31.46.12015.62.37.7%23.92.410.75040.42.37.7%27.85.832.0甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)108.34.07.5%2
25、7.01.46.42016.41.8-9.3%29.13.713.75040.81.1-6.6%24.25.628.2可的松(Cortisone)107.43.4-9.4%22.61.24.82015.42.06.7%20.52.09.05042.21.89.7%14.25.817.6氢化可的松(Hydrocortisone)107.52.0-9.7%25.01.55.42017.23.28.5%20.83.210.35039.52.1-9.5%26.87.230.4表BJ方法的精密度（续）化合物名称精密度统计结果加标浓度ng/L总均值ng/L实验室内相对标准偏差%实验室间相对标准偏差%重复性
26、限（r）ng/L再现性限（R）ng/L地塞米松(Dexamethason)108.02.06.9%15.91.1：；.72017.92.0-9.4%18.42.49.45042.02.94.8%17.04.920.5雌丽(Estrone)108.33.26.0%16.51.03.92017.81.45.0%19.01.89.75042.61.95.0%28.74.434.417-雌二醇(17-alpha-Estradiol)107.93.3-5.7%22.01.11.82017.51.37.0%21.92.611.05041.92.65.9%26.14.730.817B-雌二醉(17beatE
27、stradiol)107.84.05.8%21.11.04.72017.62.35.6%22.92.211.45040.72.8-8.1%28.06.732.4雌三醇(Estriol)108.63.4-7.1%18.31.34.62015.93.1-10.3%25.11.611.35041.42.44.8%26.73.931.0表B.2方法的正确度化合物名称加标量ng加标回收率范围%P2Sp%诺龙(Nondrolone)1060.7-97.274.227.52060.6Ill85.634.25062.310985.441.3雄烯二酮(Androstensdione)1077.7-94.285.
28、4+15.62073.810488.822.55086.411498.819.4表睾酮(Epitestosterone)1069.078.577.66.92066.711492.733.85072.0-11590.6+35.2甲睾酮(17-Methyltestosterone)1076.31078L429.02053.2-84.670.021.55067.885.075.811.3焕诺酮(Norethindrone)1064.2-90.881.744.22061.2-11180.237.75061.511381.639.0表B.2方法的正确度化合物名称加标量ng加标回收率范围%P2Sp%孕酮(
29、黄体酮)(Progesterone)1074.311884.734.92057.793.379.6+31.55061.210582.8+33.4甲地孕胡(Megetrol)1064.712391.242.62051.399.377.937.05052.811380.845.3甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)1060.812382.944.82054.411981.747.35063.31058L639.3可的松(Cortisone)1057.7-10273.533.62058.410477.031.95069.0-99.284.423.8氢化可的松(Uydrocortison
30、e)1056.2-10575.1+37.52061.0-11285.7+35.45054.911679.0+42.3地塞米松(Dexamethason)1070.310580.325.42065.811089.333.15068.110683.928.5雌酮(Estrone)1066.7-10382.6+27.42067.6-11588.834.05059.1-12385.148.717-雌二醇(17-alpha-Estradio1)1057.510479.334.92061.811887.638.85053.911583.843.417B-雌二醇(17-beat-Estradiol)1059.5-10678.4+33.32058.2-11587.840.25054.611981.445.6雌三醇(Estriol)1068.511285.831.12057.6-11579.239.85061.512382.743.9
