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1、兔出血症检测多重聚合酶链反应法标准编制说明一、项目的来源和目的兔出血症(Rabbithemorrhagicdisease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)引起兔的一种烈性、毁灭性传染病，发病率和死亡率可达100%o目前该病已呈世界性分布，给养兔业带来巨大的经济损失。兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)引起的兔的急性传染病，常引起兔的大批发病和死亡，阻碍了养兔业的健康发展。同时，Pm是一种重要的人兽共患病病原，对人类健康造成潜在威胁，具有重要公共卫生意义。为此，省质量技术监督局下达文件关于
2、下达20XX年第八批省地方标准制定(制订)项目计划通知(X质监函20XX406号)附件的编写任务通知，将兔出血症病毒及兔巴氏杆菌的检测多重聚合酶链反应法省地方标准的编制任务落实到省兽医研究所，接到任务后，省兽医研究所结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以XXX为组长，XXX等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。本操作程序是在充分参考文献资料及实验和生产应用验证的基础上，制订出适合于临床快速诊断兔出血症病毒及兔巴氏杆菌的检测标准。二、工作概况（一）在检测方法研制方面的工作情况省兽医研究所自20XX年开展省水产畜牧兽医局科研计划“兔主要传染病防控技术的研究（X鱼牧科20XX283号）
3、”项目研究以来，在兔出血症和兔巴氏杆菌相关研究上取得了以下自主研究成果：针对RHDVVP60基因和兔巴氏杆菌kmt基因设计合成的两对特异性引物；通过二重PCR体系各反应组分浓度及其组合的优化，筛选出兔出血症病毒-兔巴氏杆菌二重PCR反应最佳幅2+浓度为2.0mmolL.dNTP浓度为0.8mmolL.TaqDNA聚合酶浓度为0.08U/L、引物浓度为0.4molL,反应最佳退火温度57为、最佳PCR循环次数为28次循环。该方法针对RHDVcDNA和兔巴氏杆菌DNA的最小检出浓度分别为70pgL.62pgL,与兔大肠杆菌、兔葡萄球菌、兔链球菌等无交叉反应、多次重复检测结果一致，表明该方法敏感性好
4、、特异性强、稳定性好，可用于RHDV和兔巴氏杆菌的流行病学调查及临床诊断。利用建立方法对采自广西11市不同规模兔场共187份疑似病料，进行兔瘟病毒、兔巴氏杆菌的临床诊断。结果检出1份兔瘟阳性、10株兔巴氏杆菌阳性，其中一份为兔瘟与兔巴氏杆菌混合感染。研究结果为兔瘟、兔巴氏杆菌病的防控提供参考依据。发表文章“兔出血症病毒和巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用(畜牧与兽医，2012,44(5)：21-25)”、“兔瘟与兔巴氏杆菌混合感染的诊断和防治(黑龙江畜牧兽医,2011,12：99-101)”、“兔多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性研究(省农业科学，2010,41(11)：1219-1222)
5、”。“兔出血症病毒、兔巴氏杆菌双重PCR快速检测方法(ZL201110193531.3)”于2013年03月13日获国家发明专利授权。上述技术支持确保能完成本标准起草制定任务。(一)在标准起草方面的工作情况为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成二个小组，其中一个小组采用建立的兔出血症及兔巴氏杆菌多重聚合酶链反应对临床疑似样品进行检测，并将阳性样品进行DNA测序，测序结果与检测结果完全吻合，进一步证实该方法重复性强、准确性高，可用于兔出血症病毒和兔巴氏杆菌检测；另一个小组负责查阅国内外相关标准、技术资料和研究报告。最后课题组将
6、两个小组获得的数据和收集的材料进行汇总和整理，开始起草标准征求意见稿，并于20XX年7月完成了标准征求意见稿的起草工作。三、标准主要内容及依据（一）标准主要内容本标准根据省兽医研究所兔主要传染病防控技术的研究（X渔牧科20XX283号）项目所取得的研究成果，针对RHDVVP60基因和Pmkmt基因设计了2对特异性引物，优化建立可以快速检测上述两种病原的二重PCR,并对其特异性和敏感性进行了测定。结果表明，该二重PCR可检测出上述两种病原，而对其他兔病病原检测结果为阴性，其最低可以检测出70pgLRHDV和62pgLPm,同时结合基因克隆和序列测定证实该方法的准确性。本标准是关于RHDV和兔巴氏
7、杆菌多重PCR检测技术的地方标准，因此主要围绕该技术的试验要求来进行，主要包括试验材料、样品的采集、样品的处理、多重PCR操作程序和结果判定。其中试验材料一章规定了用于检测RHDV和巴氏杆菌的特异性引物，以及检测过程中涉及的所有试剂、耗材和仪器设备；操作程序一章规定了待检样品的预处理、不同种类样品DNA的提取、PCR检测技术以及电泳技术的详细操作步骤。本标准适用于兔出血症及兔巴氏杆菌的检测。（二）标准编制的原则1、政策性原则：本标准制定的每一项内容都遵循国家有关的法律、法规和规章制度。2、先进性原则：本标准是在参考国内、外最新的技术资料和研究报告，并进行了大量前期研究工作的基础上编制而成，目前
8、国内还没有制定出相关的技术标准，因此本标准的制定具有先进性。3、经济性原则：本标准编制过程从调查研究、资料收集到标准的起草都严格按照要求进行经费开支。4、适用性原则：本标准实用性和可操作性强，相关技术人员都能看得懂，并且能按照标准规定进行实际操作。5、规范性原则：本标准严格按照“中华人民共和国国家标准GB/TL1”的要求起草。四、技术操作测试（验证）情况和预期效果采用建立的兔出血症及兔巴氏杆菌多重PCR方法对采集自省11市不同规模兔场共187份疑似病料进行临床诊断，结果检测到1份兔出血症阳性（命名为GXBY株）、10份兔巴氏杆菌阳性。通过对GXBY株进行传统的红细胞凝集试验、动物回归试验以及V
9、P60基因克隆,证实检出的样品确为RHDV；通过对10株兔巴氏杆菌进行传统的细菌分离、培养、鉴定，证实分离到的菌株确为巴氏杆菌。传统方法耗时费力、准确率低，而建立的兔出血症及兔巴氏杆菌多重聚合酶链反应法具有敏感、特异、稳定和快捷的优点，可以在临床上推广应用，对兔出血症病毒和兔巴氏杆菌进行及时、准确的诊断，可降低兔的发病率和死亡率,对增加农民收入，加快农村经济发展步伐，保障我区绿色养兔业健康发展和食品安全等方面具有积极作用；而且对保障人类公共卫生安全也具有重要意义。五、与现行法律、法规和有关标准的关系国家标准GB/T14926.21实验动物兔出血症病毒检测方法采用血凝-血凝抑制试验和聚合酶链反应
10、法对兔出血症病毒进行检测；中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0423出口冻兔肉中兔出血症病毒检测免疫学方法中针对冻兔肉、骨髓等进行血凝-血凝抑制试验、间接血凝-间接血凝抑制试验和ELISA试验；河北省地方标准DB13/T1403兔巴氏杆菌病防治技术规程中采用传统的细菌分离、培养和鉴定对发病兔进行诊断，检测时间长、对实验设备、试剂和操作人员要求较高；而本标准可同时针对兔出血症病毒和兔巴氏杆菌进行检测。本标准制定的条款没有与现行的法律、法规及有关的国家标准中任何条款相矛盾。六、采用国际标准或国外先进标准的情况本标准为国内首创，未采用国际标准或国外先进标准。七、贯彻标准的措施和建议本标准中的检测方法，试验数据充分、科学性强，通过实验室和临床应用的反复验证，可作为推荐性地方标准在兔出血症病毒及兔巴氏杆菌的检测工作中进一步推广应用。因本标准技术方法直接针对病原基因进行检测，敏感性非常高，所以在操作过程中要特别注意避免样品交叉污染而出现的假阳性结果。此外，为规范实验操作，建议在应用本标准之前，先对操作人员进行技术培训，建议以培训班的形式推广本标准。
