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1、CD19-嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗对B-A1.1.患者凝血功能的影响及相关因素研究近年来，利用靶向嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)修饰的T细胞治疗血液系统恶性肿瘤是临床研究的热点，它已经成为治疗恶性血液病的一种新的免疫治疗方法。CAR-T细胞免疫治疗技术通过为T细胞配备精确的导航系统，来清除肿瘤细胞。2014年，CD19靶向的CAR-T细胞免疫治疗被引入治疗复发/难治性急性B淋巴细胞性白(re1.apsed/refractoryacute1.ymphob1.asticIeukemia,R/RB-A1.D1o4口今，CAR-T细月包免疫治疗成为R/RB-
2、A1.1.的一种理想方法。但与CAR-T细胞免疫治疗相关的并发症不容忽视。CAR-T细胞输注可能导致血液毒性，包括血小板计数降低2,3、部分凝血活酶时间(activatedpartiaIthrombopIastin,APTT)或凝血酶原时间(prothrombintime,PT)延长、纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)降低、低丙种球蛋白血症和弥散性血管内凝血(disseminatedintravascuIarcoagu1.ation,DIC)4,5,6o本研究应用二代CAR-T细胞对入组R/RB-A1.1.患者进行了治疗。检测患者输注CD19-CAR-T细胞前后的PT、APTT.D-二聚
3、体(D-dimer)和Fg,以及各类细胞因子的水平。观察第二代CAR-T细胞免疫治疗R/RB-A1.1.的安全性，评估凝血功能障碍、并在治疗后进行细胞因子释放综合征（cytokinereIeasesyndrome,CRS）评分及相关性分析。对象与方法一、对象本研究选取苏州大学附属第一医院2018年7月至2020年10月接受靶向CD19-CAR-T细胞免疫治疗的87例R/RB-A1.1.患者。所有患者年龄为32（20,56）岁，其中36例（41.4%）为女性。30名健康对照组为本院体检中心健康体检人群，年龄为34（22,55）岁，其中13例（43.3%）为女性。收集患者的临床资料，并检测各项指标
4、，根据共识标准对CRS严重程度进行分级7,所有患者签署知情同意书。苏州大学附属第一医院伦理委员会批准了这项研究（2015-伦理审批第70号）。二、方法（一）仪器与试剂仪器:流式细胞仪Navios（美国BeckmancouIter公司）；凝血分析仪AC1.7000（西班牙沃芬公司）。试剂：Biotin-羊抗鼠IgG（H+1.）,Strepavidin-PE（美国JacksonImmunoResearch公司），CD3-FITC（美国BeckmancouIter公司），BDCBA人Th1Th2Th17细胞因子试剂盒（美国BeetonDiCkinSon公司），氯化镁溶血剂（德国Qiagen公司）。（
5、二）CD19-CAR-T细胞比例的检测取100I外周血，加入1m1.氯化镁溶血剂，室温裂解15min,加2m1.磷酸盐缓冲盐溶液（phosphatebufferedsa1.ine,PBS）503Xg离心5min,洗涤弃上清（重复2次）。洗涤后的细胞加入4IBiotin-羊抗鼠IgG（H+1.）,混匀室温避光孵育30mino加2m1.PBS503Xg离心5min,离心洗涤弃上清，加4IStrepavidin-PE,5ICD3-FITC和5ICD45PC7,混匀室温避光孵育30min,加2m1.PBS503Xg离心5min,离心洗涤弃上清；加入500IPBS重悬细胞，上机检测，每管获取50OOO个
6、细胞（图1）oI5 %10o, , PC7CD45IO5图1CD19-CAR-T细胞检测图1A图为CD45+/SS低设门圈定淋巴细胞（B门）,IB图为圈出成熟T淋巴细胞（D门）,IC图为CD19-CAR-T细胞（E门）（三）凝血功能的检测抽取枸檬盐酸抗凝静脉血12m1.,进行凝血功能的检测。全自动血凝仪检测APTT、PT和纤维蛋白原。自动免疫比浊法测定血浆D-二聚体浓度。监测患者CD19-CAR-T细胞输注治疗0、1、4、7、9、11、13、15、18、21、24d凝血因子水平的变化。（四）各类细胞因子水平的检测采用BDTMCBA人Th1Th2ThI7细胞因子试剂盒，按厂家说明书检测IFN-、
7、TFN-Ci、I1.-2、I1.-4、I1.-6、I1.70、I1.77A等血清细胞因子。监测患者CD19-CAR-T细胞输注治疗0、1、4、7、9、11、13、15、18、21、24d凝血因子水平的变化。（五）CRS分级根据1.OCke等8提出CRS的毒性等级分级系统，对CD19-CAR-T细胞免疫治疗后，患者发热、疲劳、头痛、低血压和/或神经系统毒性等情况进行评估,将其评定为15级。大于3级代表严重危险，其中5级代表死亡。所有患者的CRS等级均由具有高级职称的临床医生进行评分。（六）统计学分析利用graphpadprism8统计软件进行统计学分析和图形编辑。2组间服用正态分布的连续性资料采
8、用正态分布的t检验，用均值土标准差表示；2组间非正态分布的连续性资料用M（Q1,Q3）表示，采用非参数秩和检验。多组间均数比较使用KruskaHWaIIis检验。各指标相关性分析，正态分布资料采用Pearson相关分析，非正态分布资料采用Spearman相关分析。指标的诊断价值采用受试者操作特征（receivergoeratingcharacteristic,ROC）曲线。Pa、I1.-2、I1.-4、I1.T0、I1.77A峰值水平与对照组比较，差异无统计学意义(P0.05);I1.-6峰值水平高于对照组，差异有统计学意义(PI1.-2、I1.-4、I1.77A峰值水平与对照组比较，差异无统
9、计学意义(P0.05);I1.-6和I1.70水平高于对照组，差异有统计学意义(P3级患者、TFN-a.,roIe-presentationstyIezztext-indent:0px;text-a1.ign:Ieft;word-spacing:normaI;overf1.ow-wrap:normaI;f1.oat:none;direction:Itr;max-width:none;max-height:none;min-width:0px;min-height:0px;border:0px;co1.or:rgb(0,0,0);top:0px;Ieft:0px;c1.ip:rect(1px1p
10、x1px1px);user-se1.ect:none;disp1.ay:iniine;transition:noneOseaseOs;vertica-aIign:0px;Iine-height:normaI;height:1px!important;width:1px!important;overfIow:hidden!important;,I1.-2、I1.-4、I1.-17A峰值水平与对照组比较，差异无统计学意义(P0.05);IFN-y、I1.-6、I1.TO水平高于对照组，且差异有统计学意义(P0.05),见表1。表1不同CRS分级组IFN-Y、TFN-,I1.-2、I1.Y、I1.f
11、、I1.-10、I1.-17A值水平(pg/m1.)CRS分IRMStIFNy(M(.)TFNa(I+8)I1.-2(i)I1.-4(五士s)I1.-6(M(,()1I1.-IOM(32164.1(15.6.&4.5)36.83.54.4i0.63.60.4432.0(198.3.604.5)3189.0(84.3.2873)a5.0t0.628.01UO.34C1.38口2,0921262210.531.64碓0.010.790.500410.010.010.20注:与CRSOjR坦比较.a0.05(四)B-A1.1.患者治疗前后凝血因子水平患者在输注CD19-CAR-T细胞后，APTT在输
12、注后第8.6(6.7,11.1)天到达高峰；PT在输注后第8.5(7.1,10.9)天到达高峰；D-二聚体在输注后第10.6(9.1,13.0)天到达高峰；而纤维蛋白原水平在输注后第12.1(8.8,14.5)天到达最低值，见图3。不同CRS分级B-A1.1.患者经CD19-CAR-T治疗后APTT、PT、D-二聚体、纤维蛋白原峰值水平比较，差异均有统计学意义(P均0.05)。49例CRSO的患者组，APTT峰值水平高于对照组，差异有统计学意义(P0.05)o21例CRS3级患者的APTT、PT、D-二聚体峰值水平明显高于对照组，而纤维蛋白原峰值水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P343图
13、3B-A1.1.患者治疗前后4个指标的变化(3A3D分别为APTT、PT、D-二聚体、纤维蛋白原变化水平)表2不同CRS分级组APTT、PT、D-二聚体、纤维蚤白原峰值水平比较(xs)CRS分圾例数APTT(S)PT(S)D-二聚体(gm1.)Fg(g1.)OiB1734.25.815,0i1.50.70.1.2.04033或2178.6i10.7a22.135a18.962a1.30.2a通9.017.926.814.21现0.010.013级患者的APTT、PT、D-二聚体峰值水平明显高于对照组，且纤维蛋白原峰值水平明显低于对照组(P3级患者组IFN-Y、I1.-6、I1.-10峰值水平高
14、于对照组，而CRSW3级患者组仅I1.-6、I1.-10峰值水平高于对照组(P0.05)oCRS各级患者的各项凝血指标和细胞因子相关性分析显示，仅D-二聚体水平与I1.TO的增加呈正相关(r=0.48,P70%(图4)o联合使用IFN-+I1.-6+I1.70指标AUC达至U95%。诊断的临界值、敏感度、特异度、AUC及P值见表3。注：IFN-Y为干扰费，I1.-6为白细胞介素-6,11-10为白细胞介素-10,CRS为细88因子糅放综合征，ROC曲戏为受试者工作特征曲线图4IFN-、I1.-6、I1.TO对重度CRS患者的ROC曲表3ROe曲线分析IFN-Y,I1.6I1.TO对重度CRS患
15、者的诊断价值身数C1.(P9m1.)9S(%)得=度（%）AUCASIFN-Y1972.785.90.790.009I1.-6265.772.790.90.9301.H-IO87381.279.80.890.0011.RI1.-6*I1.-IO73.19870.970,001注：IFN-Y为干扰豪-YI1.6为日?0版介索-6,凡-1。为曰!8为介索“0讨论2012年以来，靶向CD19-CAR-T细胞免疫治疗技术取得了巨大的成功8,9o但CAR-T细胞免疫治疗相关的并发症不容忽视，包括CRS、神经毒性、巨噬细胞活化综合征、肿瘤裂解综合征和长期不良反应10,其中最常见的毒性是CRSoCRS是由高
16、水平免疫激活导致炎症反应失去控制，从而引起CAR-T细胞免疫治疗后的综合征。多项研究结果证实细胞因子与CRS发病密切相关11,12o我们的研究结果显示，87例BA1.1.患者接受CART治疗后细胞因子在第315天达到高峰。未发生CRS的患者组，仅见I1.-6轻度升高；03时，IFN-Y、I1.-6、I1.70水平高于对照组。相关性分析显示CRS严重程度分级与I1.70、I1.-6峰值呈正相关性，即患者CRS分级越高，其I1.70、I1.-6越呈现较高水平。重度的CRS可能会致命，影响治疗效果。以往患者接受CAR-T细胞免疫治疗后CRS的评级主要依靠临床评估，缺乏客观的实验室指标。我们通过观察发
17、现，在重度CRS患者组IFN-Y、I1.-6、I1.70水平高于对照组。ROC曲线分析结果显示，在I1.-6浓度为265.7pg/m1.时，其诊断重度CRS的敏感度为72.7%,特异度为90.9%,说明I1.-6对重度CRS有较好的诊断效能，与以往报道的结果相一致13o多项研究结果也已证实炎症因子I1.-6与CRS发病密切相关14,而I1.-6参与CRS过程中毒性的中心调节。我们的研究提示，当B-A1.1.患者接受CAR-T细胞免疫治疗后，动态监测IFN-、I1.-6、I1.70细胞因子的水平，可作为判断CRS严重程度的指标，为更好地进行重度CRS评级提供客观的实验室依据。以往研究发现CAR-
18、T细胞免疫治疗之后，除了发生CRS,患者还会出现凝血功能紊乱，其中DIC可能是一个严重的且危及生命的并发症15。本研究显示，B-A1.1.患者进行CAR-T细胞输注治疗后凝血功能障碍的发生率很高。87例患者治疗后凝血功能障碍发生率为79.3%,但未出现D1.C和患者死亡。凝血功能障碍主要发生在615d,24d后基本恢复正常。且发现CRS与凝血功能紊乱密切相关。未发生CRS的患者组，无凝血功能紊乱；03时APTT、PT、Fg和D-二聚体峰值水平与对照组比较出现明显改变。由此可见，在CRS分级高的组别中凝血功能障碍的发生率更高，且更严重。以往研究也证实CAR-T细胞活化后产生的细胞因子激活了巨噬细
19、胞、内皮细胞，大量细胞因子释放导致血管内皮细胞功能障碍，破坏内皮屏障的完整性，从而出现凝血功能障碍16。大量释放的细胞因子还能进一步激活其他免疫细胞，形成正反馈效应，进而放大体内的细胞因子的效应，导致补体系统激活，凝血级联反应。而高水平的I1.-6和IFN-还可以激活凝血途径和血管内皮细胞，诱导血栓的形成17o因此推测可能I1.-6和IFN-的高水平表达诱导血栓的形成，继发性纤溶功能增强，而I1.-6升高导致中枢和外周的免疫系统反馈性分泌I1.-10,但确切的机制需要进一步研究来证实。本研究提示，在CAR-T细胞免疫治疗中，密切监测细胞因子水平和凝血功能的变化，有助于临床评估CRS水平与预防D1.C的发生，指导临床靶向选择细胞因子拮抗剂和其他药物。而与此同时细胞因子对于重度CRS的诊断具有一定的价值，可以帮助临床及时诊断和治疗危及生命的CRS的发生。目前血液恶性肿瘤的治疗已不再局限于传统治疗方法，细胞免疫治疗取得了里程碑式的进展，但同时也遇到了诸多难题，许多重要的生物学问题仍有待解决。相信随着CAR-T细胞免疫治疗更多的深入研究，将为CAR-T细胞输注后的副作用预防与治疗提供更多的可能性。
