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1、DESI-MSI技术在经典名方芍药甘草汤质量控制中应用研究目的使用超高效液相色谱-二极管阵列检测器检测法(UHPLe-DAD)和解吸电喷雾电离-离子化质谱成像技术(desorptionelectrosprayionization-massspectrometryimaging,DESl-MSI)15批芍药甘草汤(ShaOyaO-GanCao-DeCoCtion,SGD)物质基准和对应实物进行分析，考察DESI-MSl在经典名方SGD质量控制中的优势。方法以SGD为研究模型，采用传统UHPLC-DAD法建立物质基准指纹图谱，并对SGD指标成分(芍药甘、甘草甘、甘草酸)含量、出膏率进行考察。同时，
2、以芍药甘草汤对应实物冻干粉为研究载体，将其复溶后点样于定性滤纸，并固定于载玻片制成样品，以甲醇-甲酸(1000：1)为喷雾溶剂，体积流量3L/min；扫描范围m/z1001200；空间分辨率300Um；喷雾气(N2)压力0.5MPa；离子源温度120,采用正负离子全扫描样本。结果DESI-MSl法能检测到SGD指标成分芍药甘、廿草甘、廿草酸以及共有峰成分芍药内酯昔等。同时、DESl-MSI法还能检测到来自甘草、白芍的甘草皂昔G2、甘草皂甘J2、没食子酸、柠檬酸、对羟基苯甲酸等11种成分，并对其相对含量进行直观呈现，定性分析能力远强于UHPLc-DAD法。结论基于DESI-MSI技术无需进行复杂
3、的样品前处理,可以在无对照品情况下进行复杂样品的定性、相对含量分析，灵敏度高，分析能力强，可以作为经典名方物质基准、对应实物及配方颗粒样品的质控研究方法。芍药甘草汤(Shaoyao-Gancao-Decoction,SGD)源于张仲景之伤寒杂病论。该方组方精简，疗效显著，被历朝历代医家推崇，沿用至今，并且在其基础上加减化裁，用于治疗不同的病证，被广泛应用于古、现代中医临床1。现代药理学研究和临床实践也证实，SGD具有显著的解痉2、抗炎镇痛3、止咳平喘4、保肝利胆5、抗HBV病毒6、抗纤维化7、保护胃黏膜8、免疫调节9、以及抗过敏、通便、保护跟腱组织10等作用，对多种痉挛性疾病、疼痛性疾病、炎症
4、性疾病以及支气管哮喘、帕金森病、便秘等都有显著的治疗作用lll-16o作为第一批入选古代经典名方目录的复方，SGD的煎煮工艺及质量标准研究对于后续经典名方的开发具有一定的指导意义17-18。高分辨质谱广泛应用于中药化学领域，其对复杂中药化学成分的定性定量研究，可以全面展现中药及其复方的药效成分，不仅为药理学研究提供合理参考，也为中药质量标准体系的构建提供关键依据19-21。质谱成像(massspectrometryimaging,MSD作为一种新型分子成像技术，近年来多应用于药物及其代谢物体内分布研究，利用激光或离子束使样本表面分子离子化，通过串联质谱测定离子化分子质荷比，直接从动物组织切片表
5、面获得药物及其代谢物在体内的分子组成、相对丰度与空间分布状况，并以彩色图像的形式表达2227。如王中华等28应用敞开式空气动力辅助离子化-高分辨质谱成像技术对大鼠肾脏组织切片进行成像分析，得到38种肾脏内源性产物在组织中的特异性分布，直观体现了与肾脏渗透压梯度形成有关的多种小分子代谢物皮质-髓质轴向分布特征。本研究以本课题组先前研究进展为基础29,以经典名方作为研究对象，参考伤寒论原文记载的制备方法制备15批SGD物质基准，建立基于超高效液相色谱(ultra-highperformanceliquidchromatography,UHPLC)的SGD物质基准特征图谱分析方法，同时制备对应实物，
6、确定出膏率范围。并且以SGD对应实物为研究对象，建立了基于解吸电喷雾电离(desorptionelectrosprayionization,DESD离子化质谱成像技术(DESI-MSI)的经典名方质量控制方法，对多组分进行定性定量分析，为经典名方整体质量控制研究提供新思路、新方法。1材料1290Infinityu型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，包括G7167B型自动进样系统，G7166B型柱温箱，G7117A型二极管阵列检测器（DAD）；XevoG2XSqtof.DESIMSI质谱成像系统，美国沃特世科技有限公司；BS-210S型电子分析天平，天平有限公司；LD510-2型电子天平，电子有
7、限公司；H1650-W型台式高速离心机，实验室仪器开发有限公司；LGJ-IOE真空冷冻干燥机，科技发展有限公司；HDZ20型智能煎药壶，电器厂，容量2L,额定功率500W,稳定电压220V。对照品异甘草昔、新甘草甘、芹糖基甘草甘、廿草素、异甘草素、甘草次酸、苯甲酰芍药昔、氧化芍药昔、芍药内酯甘、没食子酸、没食子酸甲酯、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖、儿茶素、丹皮酚、苯甲酸、刺芒柄花素，批号分别为，质量分数均298%,生物技术有限公司；对照品芍药昔、甘草甘、甘草酸钱，批号分别为，质量分数依次为98%、93.1%、98%,购自食品药品检定研究院；水为纯净水，甲醇、乙睛为色谱纯，其他试剂均
8、为分析纯。SGD所用饮片均由盛实百草药业有限公司提供，经农业大学食品科学与药学学院教授鉴定，饮片所用药材分别为毛葭科芍药属植物芍药PaeOniaECtiflOraPalL的干燥根，豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎，详细信息见表Io表1SGD的药材来源Table1SourceofmedicinalurerialsinSGDSGD物破基准白芍炙甘草批号产地批号产地SOlH17OO71OO1安H1805440内蒙古S02S174240S01安诵H18O2I5O内蒙占S03H170114001四处H1805450内蒙古S04S174190S01安It
9、tHl700010内蒙古SOS18030602安Hl700020内蒙古S06H170106001山东Hl700030内蒙占S07H170118001四川Hl700040内蒙古S08HI8015001帙西Hl700050内蒙占S09S172910S01安微Hl700060内蒙古SlOH17O1O5OO1山东Hlsoo570It41SllH170011001陕西Hl701740内蒙古S12HI70116001四川Hl801580内蒙占SBS18O31OSO1浙江H1801S90内蒙古SHH1801(001陕西HlSo5430内蒙占S15H170117001四川H18O11.0mL,分别加至5mL量
10、瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草昔进样质量浓度为横坐标（X）,230nm波长下峰面积为纵坐标（Y）,计算得回归方程为Y=35260.159X-111.631,r2=1.0000。精密吸取“2.1.1”项下甘草酸钱对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6mL,分别加至5mL量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草酸镂进样质量浓度为横坐标（X）,254nm波长下峰面积为纵坐标（Y）,计算得回归方程为Y=IO935.277X1.25,2=0.9999。（2）精密度考察：取同一批SGD供试品溶液（S03）,按照“2.
11、1.3”项下色谱条件连续进样6次，计算芍药甘、甘草甘、甘草酸镂峰而积RSD值分别为0.15%、0.09%、0.06%,表明仪器精密度良好。（3）稳定性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法制备1批供试品溶液（S03）,分别于配制后0、2、4、8、12、24h按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药昔、甘草昔、甘草酸钱峰面积RSD值分别为0.54%、0.79%、0.83%,表明24h内供试品溶液稳定性良好。（4）重复性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法平行制备6批供试品溶液（S03）,按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药昔、甘草昔、甘草酸钱
12、质量浓度的RSD值分别为0.79%、0.77%、0.46%,表明本方法重复性良好。（5）加样回收率试验：精密称取已知各指标成分含量的SGD物质基准（S03）,分别加入等量芍药甘、甘草昔、甘草酸镂对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，结果3者平均加样回收率分别为101.73%、100.44%、99.51%,计RSD值依次为0.54%、0.79%0.83%。2.1.5 样品测定精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件测定，计算物质基准中芍药昔、甘草昔、甘草酸钱含量。结果见表2。2.1.6 SGD出膏率研究精密吸取混合均匀的“
13、2.1.2项下SGD物质基准10mL于蒸发皿中，40真空干燥至恒定质量，称量质量，根据出膏率公式计算物质基准出膏率。见表2。出膏率=WV/（VM）M表示药材质量，V表示SGD物质基准体积，V表示取样体积，W表示取样所得干膏质量表2SGD物质基准的指标成分含量及出杳率Table2IndexcomponentsconrentsanddryOXtraetrateofSGDsubstancebencbmarkSGD物质基准质量浓度/(mgmLT)出膏率必芍药甘甘草背甘草酸SOl0.660.220.3824.25S020.660.220.3825.25S030.670.210.3425.58S040.6
14、50.320.5327.75S050.620.220.4324.96S060.680.160.3424.67S070.760.120.2323.46S080.700.120.3125.96S090.600.110.2321.08SlO0.640.100.2423.00Sll0.680.090.1522.83S120.510.080.3323.79SB0.550.090.2824.71S140.700.120.3319.33S150.520.070.1624.752.1.7 SGD物质基准UPLC-DAD特征图谱研究将“2.1.5项下SGD物质基准色谱信息输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(
15、2012版)进行分析，设置SGD物质基准SOl为参照图谱，全谱峰匹配，见图1。结果显示共有峰21个，指认4个。15批SGD物质基准与对照特征图谱的相似度均0.9,符合指纹图谱相似度要求。2.2 SGD对应实物DESl-MSl研究2.2.1 SGD对应实物供试品溶液的制备按照“2.1.2”项下煎煮工艺以及表1中白芍和炙甘草饮片的配伍重新煎煮15批SGDo每批汤剂分别精密量取5mL置于IOmL罗口瓶中，使用冷冻干燥机冷冻干燥成SGD冻干粉，即对应实物。向罗口瓶中加入适量50%甲醇使对应实物复溶，将复溶液完全转移至5mL量瓶中，超声IOmin后冷却至室温，用50%甲醇定容，摇匀，用0.22Um滤膜滤
16、过，取续滤液，即得SGD对应实物供试品溶液。2.2.2 对照品样本制备取芍药昔、廿草昔、异甘草甘、新甘草甘、芹糖基甘草昔等19种对照品适量，分别置于IomL量瓶中，甲醇定容，摇匀后，使用5L定量毛细管在定性滤纸上分别点样，晾干后，打孔器在点样中心位置打孔，并将打下的圆片附在已贴好双面胶的载玻片上，见图2-Aor*mmR对照特征图谱4芍药内酝普5芍药苔9甘草苔2L甘草酸R-charactensucspectrum4-albflonn5paeomflozm9-lqmritm21-gl)cynhizcad图115批SGD物质基准(Sl315)VHPLCDAD指纹图谨Fig.1UHPLC-DADGng
17、eipnutsof15batches(SI-S15)ofSGD2.2.3 SGD对应实物样本制备取“2.2.1”项下15批SGD对应实物甲醇复溶液，使用5UL定量毛细管在定性滤纸上点样，晾干后，打孔器在点样中心位置打孔，并将打下的圆片附在已贴好双面胶的载玻片上，见图2-B。I甲，攵门时曝2-tfr2d制芒炳匠素-WSfJ*11Bb-p-15SGDTWMSWiil*bbaeotfol24*ntm3*obqmnan4qolinntiA5qusi!igmS-fl*eynzeMd9dycybetnuccd10-peomfions11*benzoyIpaeomflcnn12-Oxypaeotuflonn
18、3HbifionnI4pdhcXMi15-metyifalbrt咖c-17YJrttehml9H20exxiIdfonnooooHmbljCMrtrob*p-ukof1SbebrtofS（三）lyopkhpwdtrd2oh*dmme2D!图2各对照品（八）及SGD对应实物样本(B)F.1Referencesubstance（八）andlyophilizedpowdersampks(B)2.2.4 质谱条件解吸电喷雾电离离子源(DESI),可加热至490定制毛细管；灵敏度模式下操作，正负离子全扫描，扫描范围mzl(X)1200;空间分辨率300m;喷雾电压3kV；采样锥电压-40V；喷雾器(氮气
19、)压力0.5MPa；溶剂为甲醇-甲酸(1000：1),体积流量3Lmin;喷雾器入射角60；收集角10；总采集时间122min；离子源温度120；采样锥电压-40V；数据采集采用HDImaging软件(美国Waters公司)。2.2.5 定性分析采用XevoG2XSqtof.DesiMSl方法，按照“2.2.4”项下质谱条件对对照品样本和SGD对应实物样本进行分析，图3为正、负离子模式下分别测定的SGD对应实物样本的总离子流图。通过比对对照品样本质谱成像结果及参考相关文献报道32-39,确定各成分分子离子质荷比。ADESr图3XevoG2XSqtof.DesiMSI总通子流图Fig.3Tora
20、lioncuentofXevoGlXSqtof.DesiMSI(1)指标成分及共有峰DESl-MSI分析：根据对照品样本的质谱成像结果并参考相关文献，可以确定质荷比为m/z417.1179的分子离子源于廿草昔及其同分异构体；mz821.3974的分子离子源于廿草酸，m/z525.1599和m/z503.1523的分子离子源于芍药昔及其同分异构体，见图4。图4-A为甘草昔及其同分异构体新廿草甘、异甘草昔(m/z417.1179)在对应实物样本中的含量分布；图4-B为甘草酸的离子碎片(m/z821.3974)在对应实物样本中的含量分布；图4-C、D为芍药昔及其同分异构体芍药内酯甘(mz525.15
21、99和mz503.1523)在对应实物样本中的含量分布，指标成分质谱图见图4-ad.其他DESl-MSl详细分析结果见表3。aii星口及其两分异构体(tn1草口.昇H阜InBtr单酸c.d勺鼻。及其同分异构体(个用内tn取分就用A*bntm30dmiwom11(obantxa.woqvntwB-*lcynacXldCO-pMoasflarwadSnan(albificna)aTBUN至MOfnofeChdtmetif图4指标及共有定核成分在对应实物样本中的相对含分布F.4Rdarivtconcentditnltmdonofurgeccomponentsandcouunonpeakquliuiv
22、ecomponentfinIyopbittzedpodtrsamples表3DESIMSl分析结果Table3DESI-MSIanal5-sisresults来源名称化学式理论值（nz）实测值One）S（Xlg分子离子灸甘草竹草仔及其四分同构体（新甘草仔、异甘草仔）CjiH3XJp417.1180417.1179-0.2M-HT炙甘草甘草IeCsHeQie8213954821.39742.4M-HT炙甘草甘草素CuHl2O*255.0657255.0652-2.0M-HF炙甘草芹Ii基甘草有CIeHxQIJS49.1602549.16193.1MHf炙甘草对般基笨内酸C9H103165.054
23、6165.0541-3.0M-H-炙甘草甘草屯行A3OiHMhi983.4482983.4446-3.7M-HT炙甘草甘革电昔G2C2HwOr837.3903837.39060.4M-H-炙甘草甘草电背J2CQH0】6823.4110823.4049-7.4M-HT炙甘草22,酰基计草限C44H44OI879400887940302.5M-HT白芍芍药份及其同分异构体（芍药内函件C23tol!525.1602525.1599-06MtCOOHT503.152350315230.0M+Na白芍没食r酸CO169.0137169.0130TlM-HF白芍蔗糖Cl2011341.1078341.10
24、780.0M-HT白芍柠愫酸CO191.0186191.0184-1.0M-H-白芍6-bcm4B-wnwCYlkVand4fal*Mw4*sueMWmch-t图6自芍其他成分在对应实样本中的相时含分花及各成分质图F.6Rtbriiecoa(entdi，Cribufionofo甘草甘0.070.32mg/mL、甘草酸0.150.53mgmL,其中部分成分含量在不同批次中差异较大，除所用不同产地不同批次的饮片质量不同等原因外，在制备过程中，所选取饮片的形状、大小、以及所用饮片的取材部位都是造成物质基准质量波动的主要原因。物质基准-对应实物的出膏率为19.33%27.75%,平均出膏率为24.09
25、%,标准偏差（RE）为2.02%。特征图谱研究表明，按照中医古籍中记载的制备工艺所制的SGD物质基准具有极高的相似性，相似性均0.9,确定共有峰共有21个，指认4个，分别为芍药昔、芍药内酯昔、廿草昔、廿草酸，在对照特征图谱中分别对应5、4、9、21号色谱峰。在后续研究中，将继续对SGD对应实物进行系统研究，在相同色谱条件下测量指标成分含量并绘制指纹图谱，同时计算物质基准-对应实物之间指标成分的转移率，以期为后期经典名方制剂的研发提供中间体调配方法的制定依据。本研究应用DESI-MSI技术对SGD对应实物进行定性分析，在部分对照品缺失的情况下依然能够准确对其中14个成分进行定性，定性分析结果明显
26、优于UHPLC-DAD法。但是，在有对照品的情况下，UHPLC-DAD法可以进行定量与定性分析，而DESI-MSI定量能力却不及UHPLc-DAD法，二者各有优势。3讨论SGD组方精简，仅由白芍和炙廿草2味药材组成，因此在指标成分的选择上参考2015版中国药典中白芍和炙廿草的含量测定要求，选择芍药甘、廿草昔、甘草酸作为指标成分。传统UHPLC作为高度稳定、可靠、重现性好的分离技术，广泛应用于中药质量标准研究,但在化学成分复杂的中药复方研究上,仍存在不可避免的局限性。本研究中UHPLC针对SGD建立专属性强的特征图谱，为经典名方质量标准研究提供了有意义的参考。MSI技术常用于动植物组织切片的成像
27、研究，本研究将该技术应用于经典名方质控研究。该技术取样量少、预处理相对简单，4h即可完成15批SGD对应实物的样品分析（正、负离子模式下），远远小于UHPLC-DAD的分析时间（15批SGD物质基准共计分析11.5h）o对比分析结果，DESl-MSl获得数据信息量远大于UHPLC-DAD,还可通过复方中单味药的单煎、阴性对照等方法确定各药味在复方中的专属性化学成分，从而在无对照品的情况下，快速完成对经典名方等复方制剂的质控。本方法无需考虑流动相选择、浓度梯度设置、色谱柱分离能力、检测器适用性等常规分析手段中常见的问题。DESI-MSI虽无法对指标成分做到精确定量，但仍可通过参考各批次样品中指标
28、成分的响应值，半定量分析比较指标成分在不同样品间的含量关系。即便如此，DESI-MSl仍提供了大量的结构信息，后续可通过比较复方在DESl-MSl下各单味药单煎一合煎的成分分布关系，结合药物及其代谢物在给药动物组织切片中的分布，确定药效成分来源及作用靶点，为经典名方质量标准体系的搭建筛选更为合理的指标成分，也为后期药效物质基础研究奠定基础。研究过程中部分操作仍可改进，由MSI图谱可以看出部分成分在样本圆片上分布不均，影响了分析结果直观性，本研究虽已选择用于纸色谱的定性滤纸作为样品支持物,但仍存在由于纸纤维分布不均导致样品扩散不均匀的现象。同样,在样本制作过程中人为打孔位置、点样方式的选择等问题
29、，都会对化学成分在样本上的分布造成影响，可见研制DESI-MSl配套的标准点样仪与点样板是十分必要的。本研究仅对样本进行了一级结构分析，分析结果受同分异构体影响，后续将研究二级甚至三级结构的分析是否对分析结果有较大改善。附：芍药甘草汤的临床应用芍药甘草汤是一种由芍药和甘草这两种中药材配伍煎制而成的中药方剂，味道略微发苦，临床上的使用范围比较广。芍药甘草汤的功效主要为柔肝止痛、调和脾胃、养血敛阴。芍药甘草汤的组方为白芍和炙甘草，白芍偏寒，味苦酸，归肝经、脾经，具有平抑肝阳的功效，为该方剂中的君药；炙甘草性温，味甘，归心经、肺经、胃经、脾经，能够补中益气、滋阴养血，辅助白芍缓急止痛，为臣药。下面来
30、详细了解一下芍药甘草汤的功效和临床应用。芍药甘草汤的功效Ol柔肝止痛方中的白芍具有芍药柔肝止痛的功效，能够改善肝气郁结所导致的肝区疼痛、腹部胀痛，以及肝气不足所导致的四肢乏力和精神倦怠、厌油腻等症状。02调和脾胃由于白芍和炙甘草都入脾经和胃经，因此芍药甘草汤能够帮助食物尽快消化和吸收，有助于改善食欲不振和消化不良的症状，同时能够调理脾胃功能，改善恶心、呕吐和腹部疼痛等症状。03养血敛阴方中的炙甘草补中益气、滋阴养血，因此芍药甘草汤可用于改善阴血不足所造成的面色苍白和四肢乏力，同时对于精神倦怠和经脉失养等症状能够起到调节的功效。如果患者血虚津亏而导致手足挛急等症状，也可服用芍药廿草汤达到荣筋解痉
31、、养血生津的功效。芍药甘草汤的临床应用01芍药甘草汤治疗胃痛芍药甘草汤可以有效缓解胃痛或腹痛等造成的疼痛，对于胃溃疡、胃炎等疾病引起的胃痛有很好的治疗效果。此外，芍药甘草汤还可以改善脾胃功能，促进食物消化吸收，有助于缓解胃痛症状。02芍药甘草汤治疗胆绞痛芍药甘草汤具有清热解毒的功效，可以有效缓解胆绞痛引起的疼痛。此外，芍药甘草汤还可以改善肝胆功能，促进胆汁分泌，有助于缓解胆绞痛症状。03芍药甘草汤治疗肾绞痛芍药甘草汤具有补肾壮阳的功效，可以有效缓解肾绞痛引起的疼痛。此外，芍药甘草汤还可以改善肾功能，促进尿液排出，有助于缓解肾绞痛症状。04芍药甘草汤治疗痛风芍药甘草汤具有清热解毒、消肿止痛的功效
32、，可以有效缓解痛风引起的疼痛。此外，芍药甘草汤还可以改善肾功能，促进尿酸排出，有助于缓解痛风症状。05芍药甘草汤治疗腹泻芍药甘草汤具有调和脾胃、止泻的功效，可以有效缓解腹泻引起的腹痛和腹泻症状。此外，芍药甘草汤还可以改善脾胃功能，促进食物消化吸收，有助于缓解腹泻症状。06芍药甘草汤治疗腰痛芍药甘草汤具有补肾壮阳、祛风除湿的功效，可以有效缓解腰痛引起的疼痛和腰酸背痛症状。此外，芍药甘草汤还可以改善肾功能，促进血液循环，有助于缓解腰痛症状。总之，芍药甘草汤具有柔肝止痛、调和脾胃、养血敛阴的功效，临床应用广泛。但是，由于芍药甘草汤的药性比较温和，因此在使用时需要根据患者的具体情况进行调整，以达到最佳
33、的治疗效果。同时，患者在服用芍药甘草汤时也需要注意药物的剂量和服用时间，以免出现不良反应。芍药甘草汤化学成分、药理作用、临床应用的研究进展及其质量标志物(Q-Marker)的预测分析芍药甘草汤为国家药品监督管理局发布的古代典籍名方编目表(首批)100首古典名方之一1,最先收录至汉代医学家张仲景所著伤寒论第29条121：“伤寒，脉浮，自发汗，小便数，心烦，微恶寒，脚挛急。若厥愈足温者，更作芍药甘草汤饮与服之，其脚即能伸二芍药甘草汤由白芍和炙甘草组成，其配比与用法用量为“白芍药四两(味酸，微寒炙)，甘草四两(炙，甘平)，右二味，以水三升，煮取一升零点五，去滓，分温再服”3。方中白芍性味酸苦，具有滋
34、阴养血、柔肝缓急之功；炙甘草则具有补脾益气、缓急止痛及缓解痉挛之效；全方主治津液耗伤、阴血亏虚、筋脉失濡所致诸痛证4。质量标志物(qualitymarker,Q-Markers)由刘昌孝院士于2016年提出，是指广泛存在于各种中药材生产和传统中药加工生产中所固有存在的物质及在加工和生产的过程中产生出来的、和各种药材本身的质量功能属性相联系较为密切的物质，是具有中药安全性和有效性的标志性物质。本文在总结近几年来芍药甘草汤的化学成分、药理作用和临床应用的基础上，从质量传递与溯源、成分可测性、成分有效性、成分特有性及复方配伍环境5个方面对芍药甘草汤的Q-Marker进行预测，以此为芍药廿草汤的质量控
35、制体系建立提供参考依据。1化学成分中药复方制剂具有多成分、多靶点、多路径等复杂作用特性，中药复方活性物质的分析研究是进一步阐释其药效物质基础与作用机制的一个重点课题6。目前已对芍药甘草汤组方药材成分和全方化学成分系统地开展并进行了比较全而且深入的研究。周海玲等首次运用了高效液相色谱-飞行时间串联质谱法从芍药中分离了单菇背、糅质、有机酸和黄酮类等化学成分，并分析出其中13种主要成分的化学结构，分别为没食子酸、芍药新甘、羟基芍药甘、儿茶素、没食子酸甲酯、6-葡萄糖芍药甘、芍药内酯昔、芍药甘、芍药甘亚硫酸酯、没食子酰芍药昔、1,2,3,4,6-五没食子酰-O-P-O-葡萄糖、苯甲酰氧化芍药普及苯甲酰
36、芍药昔。崔园园等研究发现甘草蜜炙后，其中甘草素、甘草黄酮A以及异廿草昔等8种黄酮类化合物的含量明显提高，而甘草黄酮醇、甘草宁A以及毛蕊异黄酮等和72,4：三羟基5-甲氧基3-芳香豆素、红花岩黄芭香豆雌酚B的含量明显下降，该研究结果可为甘草生熟异用的主要物质基础研究提供参考。在芍药甘草汤全方化学成分研究方面，何利等9运用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)技术建立了芍药甘草汤的指纹图谱，并检测了其中没食子酸、芍药内酯甘、芍药甘、甘草昔、芹糖异甘草甘、异甘草昔、甘草酸7种成分的含量。吕欣楷等10也采用超高效液相色谱(Ultra-Perfo
37、rmarICeliquidchromatography,UPLC)技术建立了芍药甘草汤的指纹图谱，共标定了59个共有峰，并且测定了芍药内酯甘、芍药昔、甘草昔、芹糖基异甘草昔、异甘草昔、异甘草素和甘草酸镂7种水溶性成分的含量。陈彭月等11采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱技术定性分析了芍药廿草汤药渣中的16种化学成分,并通过HPLC进行了定量分析。2药理作用芍药甘草汤自古有“解痉止痛第一方”的美誉，可以滋阴养血、柔肝止痛，其药理作用主要为解痉、消炎、镇痛等12。2.1 解痉作用痉挛状态是指脑卒中、脊髓损伤等上运动神经元损伤的一种临床表现。由于运动神经元失去控制大脑皮层的能力，肌肉出现牵
38、张反射亢进、随意运动障碍等症状，从而严重影响患者肢体功能康复13。芍药廿草汤在解痉方面运用范围广泛，现代临床研究表明，芍药甘草汤可用于治疗各种肌肉痉挛性疾病12,还能够起到缓解小儿腓肠肌痉挛症和胃肠道平滑肌痉挛症等病症的作用U4。此外，李甫等U5发现芍药甘草汤能够通过控制内质网应激蛋白1(inositol-requiringenzyme1,IREl)/自噬效应蛋白I(BeClinl)信号通道，降低平滑肌细胞的Cajal间质细胞内质网应激所致的过量自噬，进而改善Oddi括约肌功能障碍(sphincterofOddidysfunction,SOD)平滑肌舒张效应U6。刘涛17从蛋白互作网络的角度分
39、析芍药甘草汤治疗脑梗死后痉挛性瘫痪的作用机制，研究结果表明白细胞介-6(interleukin-6,IL-6)血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA,VEGFA)、半胱氨酸蛋白酶3(CySteine-COntainingaSPartate-SPeCifiCPrOteaSe3,CASP3)丝裂原活化蛋白激酶8(mitogenactivatedproteinkinases8,MAPK8)等是芍药甘草汤抗痉挛的重要靶点。芍药甘草汤中炙甘草含有的榔皮素、柚皮素、7-甲氧基-2.甲基异黄酮、异鼠李素以及白芍和炙廿草都含有的山奈酚是治疗脑梗死后痉挛性瘫痪的主要
40、活性成分。黄勇等18研究发现芍药甘草汤可能通过调节痉挛性瘫痪大鼠脊髓内y-氨基丁酸(y-aminobutyricacid,GABA)甘氨酸(glycine,Gly)与5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的水平，使脊髓损伤后痉挛性瘫痪大鼠患肢肌张力降低，从而缓解痉挛状态，进而对损伤后肌痉挛疾病产生一定的疗效。黄汝成等19研究发现芍药甘草汤可缓解帕金森病大鼠脑内神经递质水平，并减轻肌强直，使帕金森病大鼠的自主活动度提高。2.2 抗炎、镇痛作用药理研究显示，白芍、甘草都具有较好的抗炎和免疫调节作用，而对于芍药甘草汤整方来说，其对一些组织和脏腑的炎症反应具有一定的抑制作用12
41、,20-22o吕璐等20认为葡萄膜炎的发病机制可归于肝急、挛缩，符合芍药甘草汤证治要点，其以白芍与炙甘草3：1的配比对眼部的葡萄膜炎进行治疗，作用机制可能与下调致炎因子IL-17的表达有关。郑东翔等21研究发现芍药廿草汤能够调节核因子-KB(nuclearfactor-B,NF-B)/环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,C0X-2)/核因子-E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)信号通路，使氯胺酮相关性膀胱炎(ketamine-associatedcystitis,KC)模型大鼠氧化应激及炎症反应得到抑制，从而使膀胱功能得到了改善,膀胱组织损伤降低，能够有效治疗KC。武禧等22研究发现芍药甘草汤可能通过嘴咤代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，喋吟代谢，乙醛酸和二殁酸代谢及三般酸循环等代谢通路，对炎症后肠易激综合征大鼠进行一定的干预。
