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1、,冰冻干燥血小板对创伤修复的治疗作用,研究背景,结 论,1,5,研究内容,2,技术路线,3,实验结果,4,研究背景-生长因子与创伤修复,研究背景-生长因子与创伤修复,基因重组细胞因子药物在美国已经开始批准应用并取得良好的临床效果。,基因重组药物的缺陷：1单一生长因子作用有限2贝卡普勒明(becaplermin）效应,研究背景-血小板与生长因子,血小板中的生长因子,生长因子在创伤修复中的作用,更天然更适合,血小板创伤修复作用的原理,研究背景-血小板与创伤修复,研究背景-血小板与创伤修复,血小板创伤修复作用的应用,商品化的PRP制备方法,研究背景-血小板与创伤修复,PRP技术的优缺点,PRP中生长
2、因子的含量是静脉血的几十倍,PRP中各种生长因子是天然的，并且比例符合体内生理水平,PRP中各种生长因子之间存在相互协同作用,PRP,高效,安全,难量化,难储存,PRP在22士2条件下振荡保存仅5d,PRP中血小板含量因人而异，甚至同一个人在不同时间血小板含量也不同,量足,研究背景-血小板冰冻干燥保存与创伤修复,冰冻干燥保存：在低温和真空环境中除去血小板保存体系中的自由水和部分结合水，得到粉末状固体，可以长时间贮存，需要使用时进行复水即可。,目前研究热 点,2006,1956,Klein等首次尝试用冷冻干燥的形式长期保存血小板,Read等用多聚甲醛固定的方法提高血小板在冻干过程中的渗透稳定性。
3、,WoIker等首次使用海藻糖和白蛋白作为冰冻干燥保护剂，在冻干血小板的研究中取得突破性的进展。,哈佛大学医学院的一个研究小组首先报道了冰冻干燥血小板创伤修复作用的研究，目前，这一研究正逐渐兴起，但仍处于实验室水平。国内未见相关报道。,研究内容,冰冻干燥血小板的制备及所含生长因子的研究冰冻干燥血小板促进创伤修复作用的研究:细胞实验 动物实验,一、冰冻干燥血小板制备及所含生长因子分析,实验结果,冰冻干燥血小板的制备,实验结果,采用本实验室自行研制的小分子糖保护法进行冻干血小板的制备,9080706050403020100,冻干血小板-20保存0d,冻干血小板-20保存30d,冻干血小板-20保存
4、90d,冻干血小板常温保存20d,新鲜血小板,与各冻干组比较a P0.05,表1 血小板提取液总蛋白含量（mg/ml）（meansSD）,图1 不同保存条件冻干血小板提取液总蛋白含量的测定结果,实验结果,与各冻干组比较a P0.05；与各冻干组比较b P0.05；,表2 不同保存时间冻干血小板生长因子浓度（n=5，meansSD）,实验结果,图2 血小板中PDGF-BB和TGF-1,二、冰冻干燥血小板促创伤 修复作用的研究,实验结果,图3 原代培养的人皮肤成纤维细胞（100）,1.冻干血小板生长因子促细胞增殖作用的分析,成纤维细胞是创伤愈合过程中最重要的修复细胞，参与了创伤修复的全过程，其数量
5、及功能变化对创伤愈合有着极大的影响。,实验结果,1.冻干血小板生长因子促细胞增殖作用的分析,潜伏期,对数生长期,平台期,图4 人皮肤成纤维细胞形态观察(100),图5 人皮肤成纤维细胞生长曲线,实验结果,1.冻干血小板生长因子促细胞增殖作用的分析,图6 MTT法测定人皮肤成纤维细胞的增殖率,*,*,*,*,*,*,*:与rhPDGF-BB治疗组比较 P0.05,实验结果,1.冻干血小板生长因子促细胞增殖作用的分析,血小板浓度数量级为106/ml用M200+2.5%FCS为稀释液,第一天和第三天坡度较陡：说明高浓度血小板生长因子对细胞增殖具有抑制作用。第五天坡度较缓和：说明较高浓度组的剩余生长因
6、子还在起作用。,图7 冻干血小板生长因子促细胞增殖作用的分析,2.冻干血小板对大鼠皮肤创伤修复作用的研究,图8 大鼠全皮层切除创面愈合过程,A 未治疗组 B rhPDGF-BB治疗组 C 新鲜血小板治疗组 D 冻干血小板治疗组,实验结果,大鼠的脊柱两侧，建立两个直4cm（12.56cm2）的圆形创口，皮层全部切除，深至筋膜。,图9 不同治疗组全层皮肤缺损创口再上皮化率,2.冻干血小板对大鼠皮肤创伤修复作用的研究,ab,ab,ab,ab,ab,*,ab,ab,ab,a:与未治疗组比较 P0.05b:与rhPDGF-BB治疗组比较 P0.05,实验结果,A 未治疗组组 B rhPDGF-BB治疗组
7、 C 新鲜血小板治疗组 D 冻干血小板治疗组,图10 创伤后不同时间愈合创口HE染色结果（100）,2.冻干血小板对大鼠皮肤创伤修复作用的研究,实验结果,A 未治疗组 B rhPDGF-BB治疗组 C 新鲜血小板治疗组 D 冻干血小板治疗组,图11 创伤后不同时间愈合创口免疫组化结果（100）,2.冻干血小板对大鼠皮肤创伤修复作用的研究,实验结果,2、血小板促进大鼠慢性难愈合创口修复的研究,大鼠的脊柱两侧，建立两个直2cm的圆形创口，皮层全部切除，深至筋膜。,图12 大鼠创口修复图示,实验结论,1.生长因子含量：冰冻干燥血小板=新鲜血小板 且二者促成纤维细胞增殖和伤口修复的能力相近2.冰冻干燥血小板中生长因子对皮肤创伤愈合成纤维细胞的促增殖作用 与单一生长因子rhPDGF-BB一样具有剂量依赖性。3.相同浓度条件下，血小板中多种生长因子的协同作用要明显优于单一 生长因子。4.粉末状的冻干血小板可水化为各种需要浓度的PRP，易于量化。5.冰冻干燥血小板对大鼠全层皮肤缺损创伤具有加快创伤愈合的作用，其效果与新鲜血小板相近，优于相同浓度的rhPDGF-BB。,
