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1、第五讲 抗炎作用实验研究思路与方法,炎症反应是临床常见病理生理过程，感染、缺血、抗原-抗体反应、化学、热或机械损伤等均可诱发炎症反应。中药中具有明确抗炎作用的药物类别有：解表药，清热药，祛风湿药，泻下药，温里药，活血化瘀药，化痰止咳平喘药，开窍药等,实验动物的选择,哺乳动物，雄性。足趾肿胀法用大鼠。过敏性炎症首选豚鼠。,常用抗炎实验方法,根据致炎性质的不同分为两大类：（一）非特异性炎症模型：致炎因子主要有：异性蛋白（如鸡蛋清）、颗粒性异物（如角叉菜胶*、棉球、酵母）、化学物质（二甲苯、松节油、甲醛）（二）免疫性炎症模型：细胞介导的超敏反应性炎症，免疫复合物介导的炎症反应模型。,（一）非特异性炎
2、症模型,非特异性炎症反应有三期：早期（急性）炎症时相，以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征；中期（亚急性）时相，以血小板粘附、白细胞和吞噬细胞的浸润为特征；炎症晚期（慢性增殖期）以纤维组织增生、纤维化和肉芽屏障形成为特征。,急性和亚急性炎症的实验方法：,1、毛细血管通透性测定：评价药物对炎症物质引起的血管通透性增加的抑制作用。【原理】常用染料渗出法，如伊文思蓝与血浆蛋白稳固结合，当致炎因子（醋酸，组织胺，5-羟色胺，PG等）诱导毛细血管通透性升高时，在一定范围内染料的漏出量可反应渗出毛细血管的血浆蛋白量。,【方法一】取雄性大鼠或小鼠，随机分组，给予受试药物、阳性药物或生理盐水。30min后
3、，在已剃毛的背部两个部位分别皮内注射组胺和5-羟色胺，立即静脉注射1%伊文思蓝溶液。15min后，处死动物，剥离背部皮肤，测量注射部位着色面积，或者剪下着色皮肤，切碎，在水-丙酮溶液中浸泡24-48h，过滤，分光光度计比色。,评价本法操作简单，但操作时应注意：伊文斯兰注入量一定要准确，滴二甲苯浸润皮肤要仔细。皮肤毛细血管通透性增高是抗炎作用研究的最常用的模型之一。操作简单，重现性较好。实验结果直观。,【方法二】取小鼠随机分组，给药1-2小时后，各鼠静脉注射0.5%伊文斯兰生理盐水溶液0.1 ml/10g，随即腹腔注射0.6%HAC 0.2ml/只，20min后处死动物，打开腹腔，用生理盐水分次
4、冲洗腹腔，合并洗涤液离心，取上清液590nm处比色测定，计算腹腔染料量，评价毛细血管通透性。,2、炎性肿胀的测定（1）小鼠耳廓肿胀法：耳廓涂抹致炎剂致炎剂：二甲苯，巴豆油合剂。（2）大鼠足趾肿胀法：足趾皮下注射致炎剂致炎剂：鸡蛋清，角叉菜胶，酵母，甲醛，右旋糖酐，酵母液，组胺，5-羟色胺，制霉菌素,检测指标大鼠足趾肿胀法，测定大鼠足趾或关节的周长、厚度或整个足趾、踝关节的容积。小鼠耳廓肿胀法，测定小鼠耳廓重量或者厚度。,【评价】脚肿胀模型是最常用的抗炎实验模型，多种化学、物理以及免疫学刺激均可导致大鼠脚爪水肿，因水肿发展和消退的快慢及持续时间不同，可将其分为急性、亚急性和慢性脚肿胀，急性脚肿胀
5、一般于给与致炎剂数十分钟或1-3小时炎症迅速发展至高峰，数小时内会消退。慢性脚肿胀于数至十日以上发展逐渐达高峰，亚急性介于中间。,化学物质刺激所致急性脚肿胀最常用，如组织胺、5-羟色胺、缓激肽、PGs、角叉菜胶、右旋糖酐、新鲜鸡蛋清、甲醛、酵母、琼脂等。芥子末、制霉菌素可以制备亚急性肿胀。,炎症慢性增殖期模型,肉芽肿模型：应用巴豆油、脱脂棉、海绵、玻璃棒、塑料环、纸片等埋入动物局部皮下，可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生，然后观察药物对肉芽重量的影响。常用方法：塑料环法；大鼠巴豆油气囊法；棉球植入法；琼脂皮下注射法等。,（二）免疫性炎症模型,细胞免疫、免疫复合物所介导的炎症反应在各
6、种风湿性疾病，尤其是类风湿性关节炎病理过程中起着主导作用，因此这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗风湿药物有重要价值。细胞介导的超敏反应性炎症系由抗原进入机体使T细胞致敏，当再次接触抗原，致敏T细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞，引起单核细胞浸润为主的局部炎症反应。免疫复合物所介导的炎症反应，系由抗原抗体形成复合物，激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子产生局部和全身炎症反应。,1、大鼠佐剂性关节炎常作为类风湿性关节炎的一种实验模型。将弗氏完全佐剂皮内注入大鼠足趾部或尾根部致炎。原发病变类似于一般炎性水肿，在致炎部位12h后出现肿胀。继发病变由迟发性超敏反应引起，在致炎10d
7、左右后出现对侧、前肢足爪肿胀，耳、尾、出现炎症结节和红斑等。,【评价】本方法特异性高，假阳性率低，结果可靠。属于免疫性关节炎模型。该模型比其他模型更接近于临床类风湿性关节炎（RA）。弗氏完全佐剂的制备是模型成败的关键。（液体石蜡：羊毛脂（2:1）共热至70，混匀，加入灭菌的卡介苗按照每毫升中加2-10mg制备。动物选择大鼠，雄性，150-200g之间，过小或老均不敏感。,2、胶原诱导的关节炎II型胶原是软骨主要成分，具有抗原性，诱发针对关节滑膜的自身免疫反应。将II型胶原加入弗氏佐剂中，皮内注射如大鼠足趾或尾根部致炎。这两种炎症模型均发生急性局部炎症期（1-4天）、急性炎症缓解期（7-12天）
8、、多发性关节炎为特征的慢性周身炎症期（10-28天）以及永久性关节畸形（第35天以后）,【评价】该模型比佐剂性关节炎模型更进一步，更贴近于人的RA，有体液免疫和细胞免疫协同作用，其病理表现为进行性滑膜炎及滑膜增生，炎性细胞浸润，软骨破坏，最终导致关节损伤和僵硬。在临床、组织学和免疫学改变上均与人的RA相似。,抗炎作用机制的研究方法,1、对炎症细胞功能的影响（1）多形核白细胞趋化性测定【原理】白细胞聚集是机体防御机制的一个重要方面。趋化因子能吸收白细胞致感染或炎症部位。测定白细胞趋化性的方法有琼脂糖法。,（2）巨噬细胞吞噬功能测定【机理】吞噬作用是吞噬细胞接触-胞饮-降解异物的过程。微生物、免疫复合物或其他异物必须先与吞噬细胞结合，才能启动这一作用。,2、抗炎与垂体-肾上腺皮质系统的关系（1）切除双侧肾上腺大鼠或小鼠的抗炎实验【原理】摘除两侧肾上腺即除去了内分泌系统（下丘脑-垂体-肾上腺轴）的影响，再进行抗炎实验，以观察药物抗炎作用是否与垂体-肾上腺系统有关。（2）血浆皮质醇含量的测定作为一个指标，结合抗炎实验进行。,3、花生四烯酸代谢测定【原理】花生四烯酸的不同代谢产物涉及炎症过程。,4、白细胞细胞因子释放实验【原理】细胞因子如白细胞介素IL-1，IL-6，IL-8，肿瘤坏死因子在炎症的发生过程中发挥重要作用。检测药物对白细胞释放上述细胞因子的影响可反映药物的抗炎活性。,
