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1、病毒性肝炎DOI：10.12449ZJCH240210中国旱獭I型干扰素受体B亚基克隆、表达及功能初步鉴定陶颖】，杨东亮2,王宝菊2,刘艺L桂文甲李智】，樊和斌】1中国人民解放军中部战区总医院感染科，武汉4300302华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科，武汉430030遹言储：绮QM,296592559(ORQD:0000-02-9602-7755)摘要：目的克隆中国旱獭I型干扰素受体亚基(mhIFNAR2)的基因，并进行抗体制备及功能鉴定。方法应用RrPCR技术，从中国旱獭脾组织中扩增得到序列，克隆至原核表达载体pRSET-B,表达重组蛋白，电泳和WesternBlot法鉴定;重组蛋白
2、常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体，免疫组化、免酸光和WesternBlot法鉴定;再通过siRNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-检验.结果从mhIFNAR2扩增出1491300bp片段，其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高,可达98.05%.成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2(50813a)蛋白的原核表达质粒，命名为pRSET-B.mhIFNAR2;其表达重组蛋白分子量27kD,纯化后纯度约为95%,浓度约为160gmL用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后，获得1:1000的特异性多克隆抗体，用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜
3、、细胞质有表达。合成的三条siRNA,其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比，可以沉默目的基因的表达，并能减干扰素的信号通路(P值均005)0结论获得mhIFNAR2的部分序列，成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，并能用于免疫组化、免疫荧光及WesternBlot的检测.用siRNA277可以抑制目的基因的表达，并能阻断干扰素的信号通路。关键词：受体，干扰素a。；克隆；乙型肝炎基金项目：国家自然科学基金(3021170);国家重大基础研究项目(973)(2005CB522900)Preliminaryident
4、ificationofthecloning,expression,andfunctionofMarmotahimalayanatypeIinterferonreceptorsubunitTAOYing1,YANGDonglianlWANGBaojif,UUYi11GUIVVenjia1,LIZhi,FANHebin1.(1.DepartmentOflnfectiousDiseases,GeneralHospitalofTheCentralTheaterCommand,Wuhan430030,China;2.DepartmentofInfectiousDiseases,UnionHospital
5、AffiliatedtoTongjiMedicalCollegeOfHuazhongUniversityOfScienceandTechnology,Wuhan430030,China)Correspondingauthor:FANHebin,296592559qq.8m(ORCID:0000-0002-9602-7755)Abstract:ObjectiveTodonethegeneofManrnotahimalayanatypeIinterferonreceptorsubunit(mhIFNAR2),andtoperformantibodypreparationandfunctionali
6、dentification.MethodsRT-PCRwasusedforamplificationinthespleentissueofMarmotahimalayanatoobtaintesequence,whichwasclonedtotheprokaryoticexpressionvectorpRSET-Btoexpresstherecombinantprotein.ElectrophoresisandWesternblotwereusedforidentification.BALB/tmicewereimmunizedwiththerecombinantproteintoprepar
7、ethepolyclonalantibodyofitsextracellulardomain;immunohistochemisby,immufluoresoenceassay,andWesternBlotwereusedforidentification,andthemethodofsiRNAblockadewasusedtoinvestigateitsfunction.Ananalysisfvariancewasusedforcomparisdcontinuousdatabetweenmultiplegroups,andtheleastsignificantdifferenceAtestw
8、asusedforcomparisonbetweentwogroups.ResultsAfragmentofmhIFNAR2(1491300bp)wasobtainedfromspleentissue,whichshewedthehighesthomologyof98.05%inmarmotAprokaryoticexpressionplasmidwassuccessfullyconstructedforexpnessioftheextracellulardomainofthemhFNAR2(三)andwasnamedpRSET-BmhIFNAR2,andtherecombinantprote
9、inexpressedbythisplasmidhadaFnolecularweightof27kD,apurityofabout95%afterpurification,andaConCentrationof160gmLAfterBALB/cmicewereimmunizedwiththepurifiedrecombinantprotein,1:1000specificpdydonalantibodieswereobtained,andimrnunohistochernistjyandimmunofluorescenceassayshowedtheexpressionincellmembra
10、neandcytoplasm.AmongtethreesiRNAssynthesizedzthesiRNAstartingfromte277locus(siRNA277)couldSienCetheexpressionoftargetgenesandweakentheinterferonSignaingpathwaycomparedwiththeblankcontrolgroupandthenegativecontrolgroup(bothP5min,弃上清；加入含10%小牛血清的RPMI1640500戊重悬细胞，每张APES处理的玻片上滴加100L,自然风干后用冰丙酮固定30min行免疫组化
11、及免疫荧光检测o用WesternBlot检测M滴度。1.2.4mhIFNAR2功能的初步鉴定1.2.4.1中国旱獭干扰素的制备将生长状态良好的BHK细胞接种到6孑施内；生长24h后，细胞长满至80%90%;溶液A:2.5g邮+Optim无血清培养基，总你肋IOoL;翩B:5LLiPofectamine2000+95LOptim无血清培养基；两者室温放置5min;混合溶液A和B,密混匀，室温道25min;期间用无菌D-hanks及培养基洗细胞两次，并加入1600L无血清培养基;溶液A+溶液B内力口入200LOPtim无血清培养基，轻柔混匀后加入培养细胞孔内；37C孵育5h;换用完全培养基2.0m
12、L培养48h后收获培养上清液，分装后冻存于-70,待测干扰素生物学活性。1.2.4.2EMeV感来商度的测定将生长在培养瓶内的WH12-6鲍肖彳垢加入Hams-12,了斓加后蝴到96孑既内,100LJL；三0胞在96孑版内长成单层后倾去培养液，滴定不同浓度的EMCV到细胞孔内，颇IO-1。，呈10倍麴!雌，100孔,同时做细胞阴性对照，每个梯度接种4孔细胞，第2天观察细胞生长状况，计数不同稀释度出现细胞病变效应（Cytopathiceffect,CPE）孑殿,Reed-Muench；去计算半数组织培养感染剂量（TQD50）.1.2.4.3中国旱獭干扰素效价的确定将生长在培养瓶中的WH12-6细
13、胞;肖化后加入Ham,s-12培养基，轻轻吹打分散细胞转种到96孔细胞培养板内；待细胞在96孔板内长成单层后倾去培养液，加入不同4倍系列稀释的BHK细胞转染上清100pL孔，每个稀释度有4个细胞孑L继续培养24h,加入O1mLEMCV,继续培养24h,以保护50%细胞不出现CPE的BHK细胞转染上清液最高稀释度作为干扰素效价。1.2.4.4SiRNA干扰魁WH12-6ffl三l10%FBS的Ham$12培养基中，于5%Co2、饱和湿度及37条件下培养。勿使细胞融合度90%以防止细胞老化。siRNA由广州锐博公司提供合成，序列见表2。另外设计一条阴性对照筋I，BlaSt验证为任何物种的无关序将正
14、常培养于6孔板的WH12-6细胞于转染前改用无抗牛素Hams-12繇24h取2LUpofectamine2000力叭250LOpti-MEM培曲，匀0室涮殍育5min取20mo合成siRNA,力叭250LOpti-MEM培养基,siRNA的终浓度分10、20及50nmol/L三个梯度，轻轻混匀，室温孵育5min0随后将两者轻轻混合，室温孵育20min加入一孔细胞中，用无血清无抗生素Hams-12培养基定容至2mLo于37、5%Co2培养箱中培养6h换为含血清、抗生素的全培养基，培养24h后加用中国旱獭干扰素刺激（同前）24h后加TriZol提取RNA。用TriZOI提取培养的WHl2-6细胞总
15、RNA,逆转录成CDNA,使用SYBRGreen嵌合荧光法进行RT-PCR扩增,反应条件为95、60s管性，95。G15s共40个翩;，6020s延伸.mhIFNAR2xMXA荧光定量RT-PCR引物序列如下：mhIFNAR2（正义）ACAATCCACCGTGCCAACT,mhIFNAR2（反义）AACAGCATCGC11TCCCTC;MxA（正义）Cagattgtctactgccaggaccaggt,ma（反义）AGCCGCTCCCAGGAACC;-actin（正义）Tggaatcctgtggcatccatgaaac,-act11（反义）Taaaacgcagctcagtaacagtccg；通
16、过标准曲线获得直线回归方程，从而得到各个目的基因mRNA的拷贝数，将其除以内参的拷贝数，然后乘以IO作为该目的基因的相对值。1.3统计学方法采用SPSSI8.0软件进行统计学分析。计量资料以；s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-检验。PQ.05）（图7）。越好277位点的SiRNA277（2OnmOI/L）对WHl2石细胞mhIFNAR2,MA基因有明显抑制作用，差异均具有统计学意义（P值均0.05）（表4）。图3pRSET-B.mhIFNAR2蛋白纯化图Figure3PurificationofpRSET-B.mhIFNAR2116.0kD-66.2kD-45.0kD-
17、35.0k一25.0kD-18.4k14.4kD图1mhIFNAR2片段核昔酸组成物种同源性比较Figure1SpecieshomologycomparisonofmhIFNAR2目的皆日济S）聂达情况M：中分子的版白质标息L2: ROSetta空箴礴号4 hL3： pRSET-B注：空白城融呦,1)P0,05;与晒懈组比SM2)PQ05.3讨论干扰素受体由a、两个亚基组成，当其与干扰素结合后迅速引起TYK2、JAKLSTATLSTAT2踊化，诙磁活转录产生各种抗病毒蛋白。尽管干扰素发现已有50年的历史，但直到1990年才鉴定出干扰素受体由a、两个亚基组成。其中亚基有长、短及可溶等三种形式&1
18、。】。随着干扰素与其受体相互作用、信号转导机制及生物应答研究的深入，干扰素受体在介导干扰素抗感染中的天然免疫、获得性免疫以及肿瘤中的作用逐渐引起人们的注意，干扰素受体缺失引起严重的病原体感染Ha】.但是，干扰素在不同的细胞中会产生相反的生物学效应.比如在大多数细胞中干扰素表现为抑制增殖，促进凋亡，却可延长记忆性T淋巴细胞的存活时间113141.因此，阐明干扰素受体复合物的功能有助于解释这些现象的原因。在乙型肝炎动物模型中阐明干扰素抗病毒的作用机制及HBV的持续性感染具有重要的临床意义。本研究利用哺乳动物干扰素受体序列的保守区设计引物，成功地从中国旱獭脾组织中克隆出mhIFNAR2i4*B0mh
19、IFNAR2i49uoo核甘酸序列与土拨鼠人、牛、羊及小鼠的同源性分别为98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%该结果与笔者前期克隆的中国旱獭其他分子相似3。干扰素是具有多种生物功能的细胞因子，其发挥效应的始动环节是与其受体结合，使胞内段发生磷酸化，激活转录从而产生各种抗病毒蛋白o本研究目的是在mhIFNAR2克隆的基础上，在体外用抗体阻断及SiRNA干扰的方法进一步证实所克隆基因的正确性，了解mhIFNAR2在干扰素信号通路的作用，为在乙型肝炎动物模型中国旱獭体内实验奠定基础。前期研究14结果显示IFNAR2与干扰素结合的重要位点包括E78、WlOl.1104以及
20、D105,而既往的一些研究I回2。1也发现干扰素受体胞外段作为免疫原可以产生中和抗体o因此本文选择了mhIFNAR2(5。一“)胞外段重组蛋白作为抗原制备抗体。本实验以胞外段InhIFNAR2重组蛋白免疫小鼠，制备了抗mhIFNAR2的多克隆抗体对所获得的抗血清进行了WesternBlot检测,证实制备的多克隆抗体特异性良好，具有免疫学活性，不仅可以识别作为免疫原的融合蛋白，还能有效识别PBMC中的mhIFNAR2蛋白免疫组化及免疫荧光检测可见mhIFNAR2抗原的分布主要呈胞浆型和胞膜型o并且免疫血清在较高稀释浓度下即可检测到mhlFNAR2蛋白，且无明显的非特异性条带，证实了多克隆抗体的高
21、效性和抗mhIFNAR2的特异性，为进一步研究mhlFNAR2及干扰素在乙型肝炎动物模型中的作用提供了实验基础。本研究用该抗体进行干扰素受体封闭实验，结果显示无明显作用(具体数据未展示),原因可能有：(1)某些抗体虽然可以与其受体结合，但是不能阻断干扰素的作用，且不同干扰素型别存在差异a】；(2)不同细胞系与抗体的结合力也存在差异(；(3)一些抗体并不能阻止干扰素与其受体结合2】。此外，本研究制备的是多克隆抗体，一是没有纯化，二是某些多克隆位点可能对干扰素信号通路产生影响。本研究设计、合成针对中国旱獭OihlFNAR2的SiRNA,并在基因水平成功验证了起始于277位点的SiRNA能够有效抑制
22、mhIFNAR2的表达，为深入研究mhIFNAR2的功能和机制，尤其是为在乙型肝炎中的研究提供了一个手段。利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：陶颖、樊和斌负责课题设计，资料分析，撰写论文；李智、刘艺、桂文甲参与收集数据，修改论文；杨东亮、王宝菊对课题进行指导；樊和斌负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。参考文献：1 ERSVAERE.SKAVLANDJ.UlvestadE.etal.EffectsofinterferongammaonnativehuanacutemyelogenousleukaemiacelIsJ.CancerIinnunolIimiunother.200
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