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1、word重组质粒的酶切鉴定与PCR实验一、【实验目的】1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；2、学习和掌握PCR反响的根本原理和操作技术，了解引物设计的根本要求。二、【实验原理】1、PCR反响根本原理PCR技术的根本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个根本反响步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序
2、列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保存复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反响原理图2、PCR反响体系与反响条件(1) 标准的PCR反响体系10扩增缓冲液10l4种dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+加双或三蒸水100 lPCR反响五要素：参加PCR反
3、响的物质主要有五种即： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链、酶、dNTP、模板和缓冲液其中需要Mg2+。(2)PCR引物设计PCR反响中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准常以信息链为基准，5端引物与位于待扩增片段5端上的一小段DNA序列一样；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。 引物设计的根本原如此 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，防止5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应
4、出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是防止3 端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否如此易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末与倒数第二个碱基，应严格要求配对，最优选择是G和C。 引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，参加其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。(3)模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
5、法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 标本处理的根本要求是除去杂质，并局部纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反响模板。(4) PCR反响条件的控制PCR反响的缓冲液 提供适宜的酸碱度与某些离子 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul 反响温度和循环次数 变性温度和时间 95，30s 退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸温度和时间 72，1min/kb(10kb内 Tm值=4(G+C) +
6、2(A+T) 循环次数 ：一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期。3、PCR的循环参数(!)预变性Initial denaturation模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2循环中的变性步骤循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时
7、间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 3引物退火Primer annealing退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验根底上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 4引物延伸引物延伸一般在72进展Taq酶最适温度。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu与其衍生物的衍生设定为1min/kbp。 5循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 6最后延伸在最后一个循环后，反响在72维持5-15分钟使引物延伸完全，并使
8、单链产物退火成双链。 三、【实验步骤】1、重组质粒的酶切、电泳检测1按下表进展加样后置于37水浴锅中反响1h试剂dd H2OBuffer重组DNAHind反响总体系体积/ul1310注意加样顺序为：dd H2O、Buffer、重组DNA、Hind。2将酶切后的片段全部即上述10ul点样进展琼脂糖凝胶电泳鉴定2、PCR扩增1PCR反响体系如下试剂dd H2OBufferdNTP引物模板Taq酶反响总体系体积/ul221202PCR反响程序与说明(a) 94 3min 预变性：预变性是让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级
9、结构充分打开。b94 30s 变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。c58 30s 退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反响体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。d72 1min 延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物与Mg离子存在的条件下，5-3的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反响。e重复b、c、d三个步骤，29个循环，使模板得到大量扩增。f72 10min：循环完成后使PCR反响完全以提高扩增产量。g4 10min16h：终止反响并保存产物。3、电泳
10、鉴定吸取上述PCR产物3ul点样进展电泳检测。四、【实验结果与分析】1、酶切电泳结果图DL 5000 DNA markeDNA/Hind分析:第一泳道:pUC19/ Hind;第二泳道：DNA/Hind； 第三、五、七、九、十一、十三泳道分别为第一、二、三、四、五、六组同学提取的未酶切的重组质粒； 第四、六、八、十、十二、十四泳道分别为第一、二、三、四、五、六组同学的酶切的重组质粒； 第十五泳道：DNA/Hind 第十六泳道：DL 5000 DNA marker我在第一组，第三泳道为我组的未酶切的重组质粒，第四泳道为酶切的重组质粒，由图可见两条明亮的带，从上往下依次为带一、带二。其中带一与第一
11、泳道pUC19/ Hind 中最亮的那条带平齐，可判断带一为线性pUC19，如此带二为插入片段，且与第二泳道DNA/Hind中第五条带平齐，于是可确定插入片段大小为2322bp。第十七至第二十二泳道为某三个小组的第二个重组子样品与相应的酶切片段。以第十八泳道为例，从上而下依次出现三条带，最亮的那条带与线性pUC19带平齐，判断为重组质粒被酶切出来的载体DNA，即pUC19,亮带下方不远那条带与未酶切的重组质粒在一水平线上，易知其为未被酶切的重组质粒，推知酶切体系中可能酶液加量不够，或酶切反响时间不够。十八泳道最下方的那条较暗的带如此为插入片段，将它与DL 5000 DNA marker比照可知
12、其大小在100-250之间，比照DNA/Hind酶切图谱可知这个插入片段即为DNA/Hind酶切开的其中大小为125bp的片段。2、PCR反响产物电泳结果图分析： 第一泳道：师姐扩增的模版 ； 第二、十五、二十泳道：DL 5000 DNA marker；第三至第十四泳道：第112组同学的以教师所提供模版的PCR产物； 第十六至十九泳道：第10、12、5、7组第二个样品。我在第1组，本组的PCR产物点在第三泳道，由图可见一条很明亮的带，此带与第一泳道样品带平齐，说明我们成功地扩增了教师的模版，此模板在DL 5000 DNA marker第六条带稍下方，可判断其大小在500-750bp之间。因为此模板为DNA/Hind酶切片段，且PCR引物大小为150bp,于是可确定模版和PCR产物大小为564bp+150bp=714bp。其它几条亮度较暗的条带如此可能为非特异性扩增产物。第十六至第十九泳道中条带较多，但它们的最亮的那条带大致平齐，可判断最亮的那条带是以他们的插入片段为模版特异性扩增的产物，将它们与DL 5000 DNA marker比照可知它们的大小略大于250bp,而引物大小为150bp，据此判断模版大小为125bp，即这些组同学们的插入片段大小为125bp，于是这些扩增产物大小为125bp+150bp=275bp。而其它的亮度较暗的条带如此可判断为非特性扩增产物。7 / 7
