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1、淀粉酶的提取、分别及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程支配：第一天样品的粗处理及粗分别，包括：1）样品处理2）离子交换色谱分别3）紫外检测（紫外测定蛋白），绘精彩谱图4）收集样品其次天对各峰收集样品进行分析，包括：1）精确测定蛋白含量（FOIin-酚）2）测定酶活3）比活计算第三天对活性峰及原液进行分析及鉴定，包括：1）SDS-PAGE分析（分子量分析）2）纯化倍数计算等蠲般一,包福全副该岛峰1.1试剂及设备离子交换树脂-20C冰箱样品管（5TOml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计-淀粉醐样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0,OQlM磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液
2、+O1M,0.3M,0.5M,1.0M的氯化钠）试剂瓶1. 2离子交换色谱原理与方法色谱（ChrOmatOgraPhy）是一种分别的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特（TWSeet）首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色,这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分别。到1907年茨维特的论文用俄文公开发表,他把这种方法命名为ChrOmatOgraPhy,即中文的色谱,这就是现代色谱这一名词的来源。但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世
3、界大战，茨维特的分别方法始终被束之高阁。20世纪20年头，很多植物化学家起先采纳色谱方法对植物提取物进行分别，色谱方法才被广泛地应用。自20世纪40年头以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的阅历方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分别方法转化为分析方法。20世纪50年头以后由于战后重建和经济发展的须要，化学工业特殊是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速便利有效的石化成分分析。而石化成分非常困难，结构非常相像，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果非常明显、有效。同样，石化工业的发展也使色谱技术特殊
4、是气相色谱得到广泛的应用。气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱渐渐成为一种工业分析必不行少的手段和工具。20世纪80年头以后我国也大规模采纳气相色谱和高效液相色谱。随着环境科学的发展，不仅须要对大量有机物质进行分别和检测，而且也要求对大量无机离子进行分别和分析。1975年美国DoW化学公司的HSmaII等人首先提出了离子交换分别抑制电导检测分析思维即提出了离子色谱这一概念离子。色谱概念一经提出便马上被商品化产业化由DoW公司组建的DioneX公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国从20世纪80年头起先引进离子色谱仪器，在我国八五、九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目，对其进行了
5、重点技术攻关。色谱的分类色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类1 .按应用领域不同分类制备色谱半制备色谱2 .以流淌相和固定相的状态分类气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳离子交换色谱离子色谱分别主要是应用离子交换的原理，采纳低交换容量的离子交换树脂来分别离子。它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速达到交换平衡。离子交换树脂耐酸碱，
6、可在任何PH范围内运用，易再生处理，运用寿命长。缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。离子色谱基本流程图如下图所示：泵检测池工一抑制器-检测器泵液进样分离检测记录离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂依据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即强酸剂阳离子交换剂弱酸剂强磴型阴离子交换剂弱磴型。1.阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、粉酸（CooH）和酚羟基（OH）等酸性基。某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3-H+Na+R-S03-Na+H+弱酸性：R-COOH+Na+R-COON
7、a+H+国产树脂中强酸l×7（上海树脂#732）和国外产品DoWeX50、ZerOIit225等都于强酸型离子交换剂。3 .阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、JNH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N（CH3）2和季胺.N（CH3）2等磴性基团。某些交换反应如下：强磴性:R-N+（CH3）2H·OH-+ClR-N+（CH3）2C1+OH-弱磴性：R-N+（CH3）2H·OH-+ClR-N+（CH3）2HCl+OH-强磴性#201号国产树脂和国外DOWeX1、DOWeX2、ZerOIitFF等都属于强磴型阴离子交换剂。（二）种类1.纤维素离子交换
8、剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE.纤维素）。2 .交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分别物质。常用的SePhadeX离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-SePhadeXA-25,A-50和QAESephadexA25,A50；阳离子交换剂有CM-S叩haetxC-50,C-50和SePhadeXC-25,C50。阴离子交换剂用英文字头A,阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。3 .琼
9、脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在SePharOSeC1.-6B上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-SePharoSe（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分别实力强等优点。交换剂的处理，再生与转型新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、殓洗涤。一般手续如下：1 .新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水2 .加4倍量0.12NHCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性3 .再加4倍量0.1-2NNaoH搅抖4小时，除磴液，水洗到中性备用。4 .将树脂带上所希望的某种
10、离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+,则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+,可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望带C1.则用HCl,希望带OH.则用NaOHo再生：用过的树脂使其欠原原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、磴液洗涤，往往只要转型处理就行了。树脂保存方法运用过的树脂用大量的去离子水洗至中性后，放置于20%酒精中，4C冰箱保存。再次运用时，需先用大量的去离子水洗至中性，再用05N氢氧化钠和0.5N氯化钠处理0.5小时，洗至中性即可运用。柱上操作交换剂装柱最简洁的交换层析柱可用磴式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树
11、脂缓慢沉降。交换剂在柱内必需分布匀称。装柱前应先在柱内保留1/3的缓冲液，并解除柱底部气泡，然后再倾入树脂。上样：向层析柱内倾入样品液洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单物质，因此除了正确选择洗脱液外还采限制流速和分布收集的方法来获得所需的单物质。1. 3试验流程1.1.1 粗酶液的制备将肯定量的发酵酶粉溶于醋酸钠或者磷酸盐缓冲液中，4浸泡12h,lXl（min,4离心10分钟，弃去沉淀，收集上清夜进行分别。（备注：这一步骤已完成）1.1.2 色谱柱的打算（装柱）按标准方法将离子交换树脂装填于色谱柱内，
12、用平衡缓冲液平衡。1.1.3 -淀粉酶的分别将肯定量的样品溶液缓慢上入色谱柱内，先后用平衡缓冲液和洗脱缓冲液洗涤，每隔2分钟收集一次样品，每个样品检测28Onm的吸光值，绘精彩谱曲线。将每个峰的样品集中起来，以备酶活和蛋白质含量的测定。（备注：详细操作步骤及上样量以PPt课件为准）蠲徐二a-波卷峰的活他例友活计算1.1试剂及设备3,5二硝基水杨酸试剂（DNS）葡萄糖标准液（IOmgZml）福林试剂淀粉溶液（IOmg/ml）磷酸盐缓冲液（pH6.0,0.02M）722型（或721型）分光光度计4OOOrZmin的离心机分析天平1. 2原理与方法1.1.1 FOIin-酚试剂测定蛋白含量FOlin
13、-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；其次步是此络合物将磷铝酸-磷铛酸试剂（FOlin试剂）还原，产生深蓝色（磷铝蓝和磷钩蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩胭法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。FoIin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和筑基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。1.1.2 淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体
14、利用。淀粉酶主要包括a-55淀粉酶和B-淀粉酶两种。Q-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的a-1,4-糖首键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。B-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：3,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在肯定时间内生成的麦
15、芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎全部植物中，特殊是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和B-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，a_淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。B-淀粉酶不耐热，在70C15min钝化。依据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本试验采纳加热的方法钝化B-淀粉酶，测出a-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（a-淀粉酶活力+B-淀粉酶活力），再减去a-淀粉酶的活力，就可求出B-淀粉酶的活力。1.3试验部分1.3.1Folin-酚试剂测定蛋白含量（按PPt课件为准，以下仅供参考）1.3. 1.1标准曲线的制作（1）
16、配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸储水溶解后转入100m1.容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸储水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馅水定容至100m1.,则配成250gm1.的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支一般试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸储水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5m1.,混合后在室温下放置IOmin,再各加0.5试剂乙，马上混合匀称（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为比照，用722型分光光度计于500
17、-650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。（3）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（Hg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。表1牛血清白蛋白标准曲线制作试剂,管号1234562501Igin1.牛血清白蛋白（m1.）00.20.40.60.81.0蒸慵水（n1.）1.00.80.60.40.20蛋白质含量（Ug）05010015020025013.1.2样品测定将各峰收集的样品经肯定稀释后,按标准曲线的步骤进行测定。以缓冲液作为空白比照。1.3.2淀粉酶活性测定13.2.1 标准曲线的绘制分别吸取1.0%葡萄糖标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0ml于50m
18、l容量瓶中,用蒸谯水制成每亳升含葡萄糖200、400、600、800、1000、120OUg的标准溶液，按表AI的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标（0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600g）,以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回来方程（Y=QC+B）。13.2.2 样品测定将各峰收集的样品经肯定稀释后按下表所示步骤操作,在反应过程中，从加入底物起先,向每支管中加入试剂的时间间隔要肯定一样：表Al反应依次样品，标准样品空白标准空白样品稀释液（ml）0.50.5蒸储水（ml）0.550预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.5（其次步
19、）1.5（其次步）混合750保温30min依次加入DNS试剂（ml）3.03.0（第一步）3.0（第一步）混合Io(TC煮沸7min（第一步）冷却蒸储水（ml）1010IO混合匀称7总体积（ml）15.015.015.0反应后的试样在室温下静置IOmin,如出现混浊需在离心机上以4,00OrPm离心IOmin,上清液以标准空白调零，在分光光度计54Onm波特长测定样品空白（AO）和样品溶液（八）的吸光值，A4为实测吸光值。用直线回来方程计算样品淀粉酶的活性。13.2.3 3活性计算酶活力单位定义：在60、PH6.0条件下，每小时从1%的可溶性淀粉溶液中释放出1微摩尔葡萄糖的酶量定义为1个酶活力
20、单位（U）淀粉酶活性U按下式计算：JJ_KX（A-Ao）XFSX（3060）X180其中：1/样品淀粉酶活性，U/ml；K标准曲线斜率；F样品溶液反应前的总量，ml；S样品测试量；表1中5=0.5ml;601小时为60min；30反应时间,mino180葡萄糖的分子量。两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。1.4数据处理依据各组分蛋白质含量和淀粉酶活性测定结果，可以计算各组分的比活（活力单位/蛋白质含量）将原液、DEAE各峰的比活结果计算出来，并说明那个部分活力最强，以此计算DEAE的纯化倍数。蠲徐三、a-沈存峰泳今淅对原液及DEAE各峰中具有淀粉酶活性的组分进行SDS-PAGE分析，详细原理及方法参考试验50（教材PII0）。
