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1、变性梯度凝胶电泳技术在废水生物处理领域中的应用I第一汪文斌，男，1980年生，本科，工程师，重要从事环境影响评价和工业废水处理设计。#通讯作者。国家自然科学基金资助项目(No.30470039)；高等学校博士学科点专题科研基金资助项目(No.)。汪文斌I郑昱2朱亮跳(1.湖州市环境科学研究所，浙江湖州313000：2.湖州市能源监察支队，浙江湖州313000；3.浙江大学环境与资源学院，浙江杭州310029)摘要变性梯度凝胶电泳(DGGE)具有可靠性强、反复性好、操作便捷等特点，已被广泛应用于环境微生物领域群落构造多样性、动态分析以及功能菌群检测等领域。鉴于生物处理是目前废水处理处置中的主体工
2、艺，通过DGGE技术研究来分析废水生物处理系统中的微生物种群多样性与群落构造动态演替，可对废水生物处理系统起到最优化设计与工程调控的指导作用。综述了DGGE技术在废水生物处理领域口勺研究与应用，并探讨了该技术在实际应用中存在的问题及其发展前景。关键词变性梯度凝胶电泳废水生物处理微生物群落构造ApplicationofDGGEinbiologicaldegradationforwastewatertreatmentWangWenbin1,ZhengYu2,Zhu1.iang3(1.EnvironmentalScienceResearchInstitute,HuzhouZhejiang313000
3、：2.EnergySourcesSupervisionDetachment,HuzhouZhejiang313000；3.CollegeofenvironmentalandresourcesciencesofZhejiangUniversity,HangzhouZhejiang310029)Abstract:Biologicaldegradationistheimportantprocessinwastewatertreatment.Accordingtodenaturingofgradientgelelectrophoresis(DGGE)analyzingofgeneticdiversit
4、yandmonitoringthedynamicofmicrobialcommunity,theproperwastewatertreatmentprocessescanbedesignedandcontrolled.TheapplicationofDGGEinstudyonbiologicaldegradationforwastewatertreatmentwasstrengthened.Inapplicationinmicrobialecology,theproblemsandprogressesofthetechnologywerediscussed.Keywords:denaturin
5、gofgradientgelelectrophoresis（DGGE）；biologicalwastewatertreatment；microbialcommunity生物处理是目前废水处理处置中0主体工艺，具有运行成本低、操作简便、出水水质好等长处，已被广泛应用于工业废水和都市污水的处理中。然而，废水生物处理工艺仍存在污泥膨胀、难降解有毒污染物导致处理系统瓦解、运行轻易失稳等问题，因此深入理解废水生物处理系统主体一一活性污泥及生物膜等的微生物生态系统B区系构成、动态变化以及功能菌群，解析群落构造、功能菌群丰度与系统运行性能之间的关系，已成为国内外学者的研究新热点卜文微生物分离培养和显微镜技术
6、等老式微生物学措施，在研究复杂的J微生态系统过程中存在很大的局限性，不能全面、精确地表征微生物多样性、种群构造以及菌群演替等生态特性；而DNA指纹图谱，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）、单链构象多态性技术（SSCP）叫末端限制性片段长度多态性（T-RF1.P）、扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析（ARDRA）等分子生物学技术的应用，大大拓宽了微生物分子生态学的研究视野，将废水生物处理领域的研究带入了一种革命性的新时代。近年来，DGGE技术因其可靠性高、分析速度快、操作简朴等特点，广泛用于分析活性污泥、生物膜B微生物遗传多样性以及群落动态演替。本文在简述DGGE技术基
7、本原理的基础上，对该技术在废水生物处理领域B应用研究进行了综述。1 DGGE技术原理DGGE是由FISCHER和1.ERMAN创立的用于DNA突变检测的一种电泳技术，其原理是基于不一样序列的DNA片段具有不一样的双螺旋解链温度（Tm）,DNA在变性剂浓度呈线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳到与Zn值相对应的变性剂浓度点时，双链DNA分子解旋变性导致电泳速度急剧下降，最终停留在凝胶中其对应的变性剂浓度位置，形成分散的条带。该技术可辨别具有相似或相近分子量的DNA片段序列差异，可到达一种核昔酸水平的突变检出率。一般，DGGE分为垂直和水平两种电泳形式。垂直电泳是指变性剂梯度方向与电泳方向垂直，重要用于
8、确定DNA片段分离的最佳变性剂梯度范围；水平电泳的J变性剂梯度方向与电泳方向平行，根据垂直电泳确定H范围可进行多种样品B同步分析。DGGE技术重要环节如下：总DNA提取及纯化；目的DNA片段PCR扩增；确定最佳变性剂梯度范围、电泳时间和温度；PCR产物DGGE分析。2 DGGE在废水生物处理微生物生态学研究中的应用进展1993年,MUYER等率先报道将DGGE技术用于微生物群落构造研究,此后十数年,该技术广泛应用于微生物分子生态学矽J研究，笔者就其在废水生物处理领域的J应用进展进行简要简介。2.1 污泥种群多样性分析目前，DGGE技术已广泛应用于环境样品的微生物群落构造或者特异种群多样性分析。
9、1.APARA等1采用DGGE技术对七段法(4个高温处理过程和3个中温处理过程)生物处理制药废水过程微生物种群多样性进行了分析，成果表明，中温池污泥样品的指纹图谱条带丰度要明显高于高温池内B污泥样品，表明反应体系温度日勺升高会减少微生物多样性。KASC)NEN等叩对处理含硫酸盐废水流化床反应器(FBR)内不一样基质条件下的污泥微生物群落构造DGGE图谱分析发现，以乳酸为电子供体的FBR内污泥菌群构造要比以乙醇为电子供体更为复杂。DAR等I应用嵌套式PCR-DGGE技术分析活性污泥中硫酸盐还原菌（SRB）多样性发现，该技术可检测丰度较低0功能菌群，使其在环境样品分子生态监测中更具有实际意义。BO
10、ON等（网采用嵌套式PCR-DGGE分析不一样废水处理厂活性污泥菌群构造发现，活性污泥形态与易引起泡沫和污泥膨胀的Actinomycetes.氨氧化菌（AOB）及AC以历“夕加，等菌群B丰度差异和群落构成具有有关性。在此基础上，对DGGE图谱的J目的条带进行割胶、回收、克隆测序可以获得更多基因水平上的遗传信息以进行开展系统发育分析，所测得的J序列信息可设计寡核甘酸探针来深入研究功能菌群空间构造。FANG等（网初次对产酸反应器中的产氢颗粒污泥（HPG）进行DGGE图谱分析，发现HPG内菌群构造较为单一，基本以低G+C革兰氏阳性菌为主,包括CIOStridiUm、BacillusStaphyloc
11、occusPapillibacterCinnamivoranaZEIN等硕士物浓缩反应器（BCR）处理含甲基叔丁基雄（MtBE）废水过程发现，该反应器内微生物种群多样性较丰富，包括a-、-/及Z-PmeoMckzVa等菌群，优势菌为HyPhOmiCrObilIm、MethylobacterhunSphingotnonasPseudomonasHalomonas,复杂的）微生物群落构造保证了反应器稳定B污染物降解效率。JlANG等应用DGGE研究发现，降解苯酚的活性污泥和颗粒污泥的群落构造相似性较低，共分离到10类苯酚降解优势菌，分属小、-Proteobacteria和高G+C革兰氏阳性菌。JI
12、ANG等1应用FISH技术分析降解苯酚好氧颗粒污泥内PG-Ol菌株空间分布，以FITC标识EUB338、TRITC标识ARCH915和Cy5标识Pand822为探针，成果表明，细菌分布在整个颗粒区域，未检出古细菌，PG-（H菌株重要分布在颗粒外表层。2.2 微生物菌群构造动态演替多种样品的同步分析是DGGE技术应用于微生物分子生态研究的一大优势，有助于迅速监测反应器启动过程污泥微生物微观生境变化，及时分析菌群构造随时间（季节）变化、环境因子影响等导致B动态演替。BC）C）N等网应用DGGE技术监测了两组生物反应器内活性污泥在氯苯胺冲击负荷下的微生物相动态变化，成果发现接种有3-CA降解菌的生物
13、强化反应器内微生物种群构造稳定，氨氧化菌的活性、丰度至第4天即开始恢复，而对照反应器内至第12天仍未见任何恢复迹象。1.lU等1研究发现两相厌氧产酸反应器启动后PH急剧下降，并伴随挥发性脂肪酸（VFA）增长、产甲烷量减少、污泥解体洗出等现象，DGGE图谱显示13d后反应器内细菌种群构造开始稳定，最终两反应器内群落构成存在着差异，在高温（55）条件下细菌种群变化速率更快，厌氧消化反应器在高温条件更易建立。刑德峰等应用双梯度一变性梯度凝胶电泳（DGDGGE）监测生物产氢反应器微生物群落的动态变化和多样性，反应器启动初期微生物种群演替迅速，15d到达顶峰后逐渐减少趋于零，群落构造的多样性下降，相似性
14、伴随演替时间增长而升高，最终趋于稳定。傅以钢等研究发现，都市污水处理系统在受到高浓度硝酸根离子冲击后微生物生态系统通过种群间协同作用恢复到原有B多样性，认为Bacillales和a-proteobacteria等优势菌群在处理过程中起着重要作用。STAMPER等田对可再生废水处理系统的J种群构造动态演替研究发现，微生物种群的多样性伴随BoD浓度跟J不一样而变化。1.APARA等123探讨不一样温度和操作条件对好氧生物废水处理过程中微生物群落构造和功能稳定性的影响，DGGE图谱揭示不一样温度条件下均获得了独特的微生物菌群构造，并认为HRT同样是污泥菌群构造变化的调控因子之一。此外，Tartako
15、vsky等网采用hplc化学分析技术，发现uasb对五氯酚降解菌附迅速筛选过程相继将目的污染物转化为3,4,5-三氯酚、3,5-二氯酚、3-氯酚、苯酚，结合DGGE图谱分析发现反应器启动17d后出现Clostridiumacetobutylicum/C.heijerinckii.,TCP对位脱氯伴随有两个条带出现，属于CloStridiIlm和SyntrophotnonasZSyntrophobacter,DCPB间位脱氯也伴随有Syntrophotnonas和SyntrophusB出现,但此类菌也存在于对照反应器中，由此可推断PCP及其中间产物0还原脱氯应C/os画皿作用所致。1.l等同在好
16、氧污泥颗粒化过程微生物动态分析试验中发现，污泥颗粒化过程微生物种群构造演替明显，伴随污泥颗粒化而出现特异性条带。污泥颗粒化过程微生物群落构造动态演替明显，优势菌群分属B-,-ProteobacteriaFlavobacterium等类群。2.3 污泥微生物群落构造研究虽然DGGE技术只能对微生物群落多样性、菌群种类进行分析鉴定，无法获得菌落形态、空间分布等信息，但结合荧光原位杂交(FISH)、点印迹杂交(DOt-blothybridization)等分子生物学技术，可以克服DGGE技术的局限性，深入理解颗粒污泥、生物膜等特殊微生物系统的群落构造与功能。AHN等1261研究了3组不一样电子受体的
17、SBR反应器(RAA反应器：O2,RAN反应器：02、NO3-,RNN反应器：N3)接种聚磷菌(PAOs)后的微生物群落构造变化，成果表明，RNN内污泥种群构造最复杂，而RAAaJ微生物种类较RAN少，每组反应器内均存在RhodoeyChiSSP.和DechloritnonasSP.两类反硝化聚磷菌(DNPAOS)OFlSH成果表明，Rhod。CyCiUSSP.在3个反应器中均属于优势菌群，且呈葡萄串菌落形态存在，而DechIonmonas印.数量较少。厌氧生物反应器效率跟氨氮浓度亲密有关，氨氮浓度的不停提高使UASB反应器的CoD清除效率下降，DGGE和FISH研究成果表明，产甲烷细菌群落构
18、成和构造均发生明显的变化，Methanosaeta及有关菌群的丰度和活性下降，而Methanosarcina.MethanobactenumJ?Methanospirillium等菌群在反应器运行过程中可以保持一定的数量级，但Me法即OSmr%从单一细胞汇集成为细胞群，认为这种存在形态有助于其抵御高浓度氨氮冲击影响，可维持反应器运行稳定性如。膜好氧生物反应器（MABR）通过膜腔体供氧，实现向反应器日勺无泡曝气，可以在单毕生物膜上完毕硝化反硝化反应。有研究表明28,与活性污泥相比MABR具有独特而复杂的微生物群落构造；对目的条带进行克隆和序列分析发现隔阂附近的重要菌群为-和P-Proteobac
19、teria,而远离隔阂厌氧区域内重要包括Bacteriodetes及a-%、-和S-Proteobacteria对氨氧化菌（AOB）和反硝化菌（nirS,MrK）B竞争性定量PCR成果表明，2、14CmzS流速下生物膜内Ac）B、MrS和加-K分布状况不一样，由此可推断出流速是影响生物膜内微生物种群构造的重要原因。1.ANTHIER等网采用厌氧固定膜反应器（FF）降解PCP,DGGE成果表明，反应器启动56d后微生物群落趋于稳定，与接种污泥相比生物膜内细菌种群构造发生了明显的J变化，相似性低于0.3；古细菌种类比细菌少，群落构成变化不明显，表明产甲烷菌在UASB和厌氧FF反应器内的种类基本相似
20、；结合FISH技术发现，由球菌、球杆菌和杆菌构成的细菌群落约占总菌群的70%,而古细菌丰度只有10%左右，大部分为甲烷菌，此外发现PCP降解菌Desulfitohacterium.Hafniense占总菌群的I19%左右，分散于整个生物膜内，这种特性有助于保持微生物群落的稳定。3展望迄今为止，以基因组DNA或RNA为研究对象的DGGE技术克服了老式微生物措施的多种弊端，可迅速表征微生物遗传特性，已成为废水处理过程微生物群落构造分析、动态演替监测方面强有力的常规分子生物学研究手段，但同步还存在只能分析500bp如下的DNA片段Ml、只能检测到样品中占1%以上的优势菌群等局限性，此外细胞裂解与否充
21、足、DNA提取和纯化时口勺偏差、电泳操作条件的变化等都将影响DGGE的分析成果。尽管DGGE技术存在以上局限性，但其与实时定量PCR（realtimeandquantitativePCR16SrRNA文库构建(16SrRNAgenelibraries)FISH等分子生物技术相耦合，有望深入揭示微生物群落B构造与功能，借助于功能基因标识或者信使RNA(mRNA)日勺PCR扩增可获得微生物群落内部特定B代谢信息，此外结合老式0分离培养、化学分析等措施可深入理解微生物B功能及其生理生态特性，为建立数学模型、设计处理系统及优化操作等提供理论根据。综上，结合其他分子生物学手段、老式微生物技术和化学分析措
22、施，对于丰富和发展废水生物处理B微生物学理论、加强工程技术B可控性具有重要B意义。参照文献1 WI1.DERERPA,BungartzHJ,1.emmerH,etal.ModensciencemethodsandtheirpotentialinwastewaterscienceandtechnologyJ.WaterRes.2023,36：370-393.2 WANGERM,1.OYA.BacterialcommunitycompositionandfunctioninsewagetreatmentsystemJ.CurrentOpinioninBiotech.,2023,13：218-227
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