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1、超临界流体色谱基础导论90：AgiIentTechnoIogies目录目录川引言X1.1.1.符号XIV缩写XIV1超临界流体色谱简介11.1 什么是SFC11.2 为什么采用SFC213SFC能够分离哪些化合物1214这一名称的含义162流动相192.1 为什么使用CO2?192.2 使用100%CO2212.3 改性剂或共溶剂232.4 添加剂312.5 添加水以扩展溶质极性343固定相353.1 材料353.2 非手性键合料353.3 固定相比枕403.4 填料粒径与色谱柱尺寸之间的关系413.5 推荐的色谱柱尺寸453.6 用于手性分离的色谱柱484流动相变量对保留值和选择性的影响49
2、4.1 改性剂浓度494.2 温度504.3 压力534.4 流速554.5 可控变量对保留时间和选择性的影响概述575方法开发585.1 溶质与固定相极性的匹配-585.2 极性窗口605.3 入门指南605.4 极性溶质615.5 低极性溶质645.6 多变量方法656非手性分离666.1 案例研究1一典型的低极性样品666.2 案例研究2中等极性样品716.3 案例研究3磺胺类药物836.4 其他结R897手性分离907.1 背景907.2 对映体过量率测定917.3 用于手性分离的正相技术-917.4 可控变量对手性分离的影响937.5 开发手性方法-988SFC定量分析1038.1
3、验证阶段1038.2 开发方法用于定量分析饮料和食品中的山梨酸盐、苯甲酸盐和咖啡因1058.3 校正10884苯甲酸盐、山梨酸盐和咖啡因的定量分析结果总结1168.5 手性分离1169仪器注意事项1219.1 泵1219.2 UV检测器优化1249.3 双梯度1379.4 自动进样器注意事项1389.5 其他1469.6 SFC的超高性能1489.7 在SFC与HP1.C之间切换的混合型系统1509.8 质谱接口1549.9 其他检测器156引言本基础导论旨在取代作者在1995年首次由Roya1.SocietyofChemistry出版的著作填充柱SFC（PackedCo1.umnSFC）o这
4、本原著从根本上改变了分离科学中对SFC的看法，使现代SFC更类似于HP1.C而非GC。这一观念将在本基础导论中得到延续和扩展。第一章介绍了SFC的一些基本原理，同时还讨论了在现代分析实验室采用该技术的理论依据、动机和优势。后续章节将更详细地回顾流动相和固定相及其对重要色谱特性（保留值和选择性）的影响。一本关于分离科学的基础导论离开对目标技术实施（包括应用领域）的深入讨论肯定是不全面的.这些内容将包含在有关方法开发.非手性和手性分离以及定量分析的章节中。最后,本书还将讨论仪器注意事项.包括对流动相输送、进样和校测各方面关键信息的详细解释。符号AvanDeemter方程中涡流扩散的影响BvanDe
5、emter方程中纵向扩散的影响CvanDeemter方程中径向护散的影的D流动相中的溶质二元扩散系数dP粒径H塔板高度k分配比流动相的线速度P分配系数P,洗脱强度（根据SnYder）P分离柱的压降I编写词1:ACN乙胞BPR反压调节器CZE毛细管区带电泳EtOH乙醉FID火焰离子化检测器GC气相色谱HP1.C高效液相色谱id内径IPA异丙葬IPAm异丙胺MeOH甲库MS质谱仪R1.折射率RSD相对标准偏差SFC超临界流体色谱TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四宝味哺UHP1.C超高效液相色谱UV紫外超临界流体色谱简介1.1超临界流体色谱(SFC)是一种分离技术,其使用的仪器装置与高效液相什么是S
6、FC色谱(HP1.C)几乎完全相同。此技术可分离复杂的混合物,并可测定混合物中各个组分的含量，有时还可以鉴定组分。样品溶液注入高压液流之后.液流会将样品带入填充有细颗粒的管或色谱柱中。样品中的各个组分会与颗粒表面发生不同的相互作用，当其穿过色谱柱时即可在时间和空间上实现分离。组分将以不同的时间从色谱柱中流出，得到高斯或伪高斯峰.然后流过检测器。此技术与HP1.C的最显著差异在于用高密度压缩气体替代了大多数液体流动相，该高密度压缩气体几乎都采用二氧化碳(CO丸在高压条件(例如高于80bar)下，C(h充当溶剂。由于它是一种压缩气体，因此系统出口需要配备反压调节器以确保整个色谱仪中的流动相保持单一
7、的密度。于是，这就要求一些检测器,如紫外(UV)检测器，能够在高压下运行。C0?是一种高度非极性溶剂.类似于烧类，但属于不同的溶剂系列。因此,对于极性较强的溶质，需要向流动相中加入有机改性剂(有时称作共溶剂)，主要为醉类。洗脱时通常采用由低到高的改性剂浓度进行梯度洗脱.色谱峰则按极性由低到高的顺序洗脱出来。对于许多强极性溶质,它们与固定相的相互作用过强.通常无法洗脱出来或洗脱得到的峰形很差。此问题通常通过向流动相添加强极性添加剂(例如，将强酸或碱溶解于改性剂中)得到解决。SFC通常是一种正招技术,因为组分按极性由低到高的程序运行。然而,SFC与正相HP1.C相比具有显著的优势，其平衡速度极快，
8、重现性非常出色,甚至可以进行水性样品分析。对于极性溶质,需使用极性固定相。经典的极性固定相包括裸硅胶.氟基、二醇和氨基固定相。过去几年中，研究人员专门针对SFC开发出了大量新型固定相。这些固定相包括多种乙基叱碇固定相和许多专利固定相。对于极性较低的溶质，有时会使用反相柱，如CI8、C8、C4和甲基柱。最近几年，亚2m颗粒的使用变得相当普遍。然而，过去几十年中，SFC的主要应用领域为手性分离6:。SFC使用的色谱柱与HP1.C相同。虽然最高效的老式手性色谱柱为涂覆且未经键合的色谱柱，但新型键合固定相尚未取代涂覆色谱柱，因为涂覆色谱柱具有卓越的选择性且比较容易优化。SFC还可用于分离极性很低的化合
9、物，例如许多天然产物，包括脂溶性维生素.类胡萝卜素和脂质。对于此类样品，常以C18作为固定相。1.2为什么采用SFCvanDeemter(Knox)方程描述了色谱柱的动力学性能。在其最简单的形式中，该方程由三项组成.每项描述了不同形式的扩散，参见公式1.1。1.2.1分析速度更快H=d33+空上+PD1.2公式1.1vanDeemier(Knox方程。8项和。项分别表示纵向扩散和径向扩散的影响，并且方程中包含流动相中溶质二元扩散系数与流动相线速度之比。B项说明扩散系数越高将导致最佳线速度越高。在C项中，较高的扩散系数将使较高流速下的柱效损失较小。纯CO2中的扩散系数比水或水性混合物中的扩散系数
10、大约快10至15倍。例如,苯甲酸在水中的扩散系数为1.0X105cms（在20。C下）8。在100%C02中,苯甲酸的扩散系数为16X10,c（在IOOba和40下），30Obar时下降至大约9.5X10cK类似地，一些稍大的二甲基苯胺类化合物在150和35Oba之间（40至60。C条件下）的扩散系数介于7M12.5105cm2s1之间上CO?分子的分子间相互作用很弱。因此，它在室温和大气压下为气体。当这些分子被迫接近（压缩）时，所得到的高密度流体可充当溶剂。然而，即使在较高的密度下，其分子间力仍然较弱。因此，溶解在CO2中的其他化合物可以迅速扩散。近年来，SFC已经很少使用纯CCh进行操作。
11、添加极性改性剂（例如，甲醉、乙醇或异丙醉等醇类）能够显著减小扩散系数。仅添加5.5%甲障即可使扩散系数减小近一半”，浓度更高，此效应将更显著。例如，锦葵色素35-二葡糖甘”的分子量为670,与许多药物类小分子相比是一个相当大的分子且具有许多极性官能团。采用含20%甲醒的CO2并在200bar条件下操作时，其扩散系数仍然比在大气压（40至60）条件下纯甲醇中的扩散系数高出4.7至5.1倍，如图1.1所示。经证实，极性溶质被极性改性剂团簇包围.并且由于团簇的横截面积增大，导致这一较大的溶剂化体扩散速度减慢图11分子量为670的德葵色素-35二葡塘昔在C0Me0H混合物中的扩散系数。在200bar下
12、采集得到COMeOH数据,在大气压下采集得到纯MeOH数据。在相同温度下,采用20%改性剂时得到的扩散系数比纯MeoH中的扩散系数高出5.08.4.50和4.70倍由于SFC通常采用5至50%的改性剂，通常认为SFC采用改性的流动相时在相同的色谱效率和相同粒径的填料下，分析速度比HP1.C高出3至5倍。这一结果在使用以亚2m颗粒填充的色谱柱时仍然成立。这意味着使用相同粒径的色谱柱时，SFC的运行时间只有HP1.C（或UHP1.e）的1/3至1/5,而通量则高出3到5倍。平衡速度很快,使得梯度分析的循环时间缩短。分子越小，扩散系数越高。遗憾的是，文献中有关小分子在改性C02中的扩散系数数据非常少
13、。文献中的大多数扩散系数值如表1.1所列。溶质温度压力Ducm2s,5%MeOH5.5%MeOH10%MeOH2-硝基苯甲醛40200bar7.81057.22X105300bar6.8510s6.25膜50200bar8.36107.56104300bar7.521056.76105二氯江40200bar9.361068.47x106300bar7.98x1047.610b叔丁基笨50200bar8.331057.57X105W庭55173bar7.78106笨甲酸55173bar6.69105菲55173bar10.0105表11几种小分子在添加有低浓度甲醇的CO2中的犷散系数1.2.2较
14、弱的分子间相互作用在导致扩散系数升高的同时，还将使纯CO2及改压降较低性CO2的粘度降低。如果我们暂时忽略100%CO2并将重点集中在改性CO2,图1.2展示了文献”报道的水/甲醇混合物在40和60OC下的粘度值以及水/乙睛在60下的粘度值。将这些HP1.C类似条件与CO2/甲醉混合物的值（根据测得的SFC色谱柱在50OC下的压降P）估算所得）进行比较，外推获得100%甲醇（虚线）的相应值。水基测量结果在恒定压力下获得.CO?/甲醉的测量结果在压力200-400bar.恒定流速条件下获得。H2OZMeOH, 40 * H20ACN, 60 H2OZMeOK 60 * CO/MeOH. 50 图
15、12HQMeOH.%OACN和C(VMeoH混合物的粘度作为改性剂摩尔分数的函数,色港柱的压降与粘度直接相关20世纪90年代后期，重新流行使用亚2m颗粒，但这些填料大多为薄壳型且通常填充于毛细管中，随后出现了小粒径的表面多孔颗粒。2003年,安捷伦推出了首款全多孔亚2m颗粒。根据VanDeemter方程.此类颗粒与5m颗粒相比,在柱效相同的情况下,能够使分析速度提高九倍或十倍。这些较小的颗粒产生的压降(P)远大于老式较大的颗粒，因为AP与dp?成正比(在柱效相同的情况下)。在HP1.C中使用亚2pm颗粒有时需要泵能够耐受1000bar以上的压力。在SFC中，CO)/改性剂混合物的粘度明显低于水
16、性流体，如图1.2底部曲线所示。那么，即使在更高的流速下，AP值也远低于HP1.Co在SFC中，即使在柱长IOOmm的色谱柱中使用18m颗粒，压降超过40Obar的情况实际上也是不常见的。实验在出口压力恒定但流速不同的条件下，绘制了几根3,5和1.8m颗粒填充色谱柱的AP与改性剂百分比的关系图。结果分别如图1.3和图1.4所示。 4.6*5。mm,1.8m,5m1.min,出口压力15Obar *4.650mm,1.8m,5m1.min,出口压力IOObar-4.6150mm,3.5m,3m1.min,出口压力15Obar 4.6X250mm,5m.2m1.min.出口压力15Obar图1.3
17、当CO2中包含不同浓度的甲群时,几根ZORBAXRXSi1.色谱柱在50下的压降（扣除了管路造成的必）柱头压力bar450400-350-300-250-200-150-100-50-O-I111I01234流速m1.min图1.4使用3X10OmmX1.8叩ZORBAXRX-SiI色谱柱在含有22.5%甲醇的COz.150bar出口压力和50cC条件下得到的柱头压力,最佳流速大约为1.8m1./min简而言之,采用亚2m颗粒的现代HP1.C通常在40至最高70的高温下操作，以便降低粘度和压降。SFC通常在40至60。C之间操作，但原因则截然不同。根据经验，在流速高出3至.5倍的情况下，SFC
18、中的AP仅为HP1.C中的1/3到1/5。在SFC中实际上不需要使用超高压泵，除芈使用以亚2m颗粒填充的长色谱柱或在极高的流速下操作。1.2.3与反相HP1.C相正交次要组分通常与主要组分具有化学相似性，使用任何一种技术时，次要组分均在主要组分附近甚至紧靠着主要组分洗脱出来。对于个别样品.也许需要使用不同选择性的多种方法。然而，人们通常使用两种不同的反相方法，均采用C18固定相以分离此类共洗脱物。如同正相HP1.C或SFC那样的正交技术提供了一种出色的替代选择，能够显著降低丢失此类共洗脱化合物的风险。SFC应该是优选的技术，因为它更快速、更少使用有害改性剂，而且产生的有毒废液也少得多。SFC中
19、任何一组色谱峰的保留顺序都与反相HP1.C中的保留顺序大致相反,图1.5所示是一个典型的示例，其中各溶质代表了多种官能团,包括磺胺类,皮质类固醇和氧杂慈。这种选择性上的重大变化非常有用，具有不同化学相互作用的两种分离机制有很好的效果。在信号未能及时返回基线时，主要组分通常会出现疹尾蜂。如果次要组分共洗脱或在主要组分的尾部洗脱出来，就很难（或不可能）对次要组分进行任何精度的定量分析。但是，如果次要组分在主要组分之前（基线平坦处）洗脱出来,则可能更容易地获得具有更高精密度和准确度的定量分析结果。3.4, 5, 64.05.0时间minmAU120SFC1g0；12次重叠进样60-40-20-吐07
20、00-600-500-400-300-200-100-0-.01.01.图1.5SFC与反相HP1.C互为正交。比较下列混合物的SFC和HP1.C色谱图：1.MS.2.,3.可的松,4.强的松,5.氢化可的松.6.泼尼松龙，7.横胺甲基喀症.8.磺胺喳恶吼SFC条件4m1.min.含5%至25%甲静的CO2,3min。出口压力150bar,采用4.6x15OmmX51JmRX-S1.1.色谱柱。HP1.C条件：1.5m1.nin.10%至90%甲群水溶液,4.5mi,40,采用4.6x15OmmX2.71MnPoroShe1.1.c18色谱柱*安捷伦分析型SFC/UHP1.C复合系统能够在几分
21、钟内实现反相HP1.C与SFC之间的快速来回切换。用户可以对操作序列进行编程，自动完成此类比较。这有利于对同一样品连续运行两种方法，使用截然不同的选择性（一种为反相，另一种为正相）并在很短的时间内完成。图1.5所示的色谱图仅作为示例。执行六次SFC分析，然后执行六次反相HP1.C分析，再执行四次SFC分析和四次反相HP1.C分析，最后执行两次SFC分析。然后将所有的SFC和反相HP1.C分析结果叠加在一起。1.2.4分离手性及其他异构体反相HP1.C主要依靠疏水作用的差异来分离化合物。正相技术则主要依靠极性极性相互作用，并可更好地区分形状的细微差异，尤其是极性官能团周围的分子形状。因此,正相H
22、P1.C的典型应用领域是异构体的分离，此类分离是基于分子形状的差异来实现。大多数药物都具有手性.意味着它们具有成对的异构体.彼此互为镜像,称为对映异构体。包含相同浓度对映异构体混合物称为外消旋体，以前的合成方法几乎总是得到外消旋体。然而,各种对映异构体通常具有独特的生物活性。因此，美国食品药品监督管理局及许多其他监管机构要求全面测试每种纯对映异构体。纯对映异构体的药物还可能再次获得专利授权.因为纯对映异构体通常药效更快,且毒性低于以往的外消旋体。基于这些因素，人们对通过色谱分离对映异构体的需求日益增长。过去20年来，已证实SFC在分离对映异构体及其他异构体方面优于正相HP1.C。事实上，许多大
23、型制药公司均已关注SFC在这些应用中的潜力。例如,CraigWhite6（当时运营一家分析型和半制备型纯化服务实验室）在一年中分析了实验室收到的所有手性样品，共计数百个样品。在96%的分离中，均证实SFC在分析速度和分离度方面更加出色。事实上,SFC随后被指定为分析型和半制备型手性分离的主要技术，而HP1.C仅用于评估SFC的疑难样品。类似的是,MohammedMaftouh7对500种专利药物进行了评估，通过SFC仅用四种过去的（涂覆.未键合）手性固定相即可获得95%的分析成功率。采用同一系统对一组98种市售药物进行分析，获得了98%的成功率。自2006年以来，他们使用SFC作为初筛方法，采
24、用毛细管区带电泳（CZE）作为备用方法。P位er和Merck对于SFC在手性分离领域的价值也都发表了类似但稍欠明确的看法。1.2.5在SFC中，AP值较低，使其易于获得较高的柱效。色谱柱可以（并且效率更高通常）串联使用，通过这种方式,可将相同或不同的固定相结合起来。手性与非手性色谱柱均可联接。在最早的示例中屿，将柱长均为200mm的11根色谱柱联接起来得到长2.2m的色谱柱5m颗粒），在400ba的系统下能够获得220000以上的塔板数。在另一个示例中,将多达五根不同的手性柱联接后可得到伪通用固定相二或者，使用亚2m颗粒填充的长色谱柱可获得相当高的柱效，因为压降很低。安捷伦分析型SFC系统能够
25、在60Obar条件下运行，它支持采用柱长大约为05m的色谱柱，理论上能够获得高达139000的塔板数。1.2.6运行成本更低SFC中使用的CO?大多数为食品或饮料级，由于可供人们食用，因此其纯度受到监管。碳酸饮料无所不在.其配送设施几乎遍布全球.且消费量巨大。因此,CO?比较廉价。在高压（50至70bar）钢瓶中（25kg）,液态CO2的价格仅为1美元/千克。SFC中所用的典型流速为1至3m1.min,意味着一瓶气能够持续使用大约200小时。CO2还提供杜瓦瓶和贮罐配置,两种形式均在-30至-4020至30bar）条件下低温操作。杜瓦瓶一般可容纳大约150kg,但是不如钢瓶或贮罐方便。杜瓦瓶装
26、C02的成本与钢瓶大致相同.但持续使用时间要长6倍。贮罐通常仅在机构致力于大规模使用SFC时才会安装。贮罐装CO2的成本可下降一个数量级，达到0.10美元/升。其成本与庚烷相比更具优势,购买四瓶庚烷（4升/瓶）的成本可超过70美元/升。杜瓦瓶和贮罐都需要使用升压泵或气体输送系统将压力由大约20bar升至70bar以上，从而使往复泵能够泵送气体。采用贮罐时，CO2通常通过管路连接至机构内的多个位置。在SFC中,很少使用昂贵且有毒的乙睛。代之以廉价的醇类。而且,典型操作由较低的B（如5%）开始，但很少超过40%。因此，大多数流动相都是廉价的CO2o在色谱分析结束时，流动相会减压并出现两相形态，一相
27、为气态.另一相为液态。气态CO?会被排出，而液态改性剂将被收集到捕集阱中。由于大多数流动相都会蒸发，因此会大大减少废液的体积。产生的废液毒性也较小。人工成本是色谱运行过程中最重要的一项费用。由于较高的扩散系数决定了在色谱柱尺寸相同的情况下SFC能够采用比HP1.C更高的流速和更短的运行时间，一个操作者在同一时间段内能够完成三至五倍的更多工作量。1.2.7环境友好尽管使用CO2作为主要流体，SFC仍可视为一种环境友好或绿色技术.因为CO?能够从其他行业中回收利用。在HP1.C中,流动相通常在使用后燃烧生成新的Co2。使用低浓度醇类代替乙睛能够降低毒性。由于C02会在系统末尾处蒸发，因此大大减少了
28、处置大量有毒废液的昂贵成本。1.3SFC能够分离哪些化合物根据经验，任何可溶于甲醇或低极性溶剂中的化合物均可通过SFC得到良好的分离匚相反，需要使用完全水性的缓冲溶液来溶解的化合物可能很难通过SFC进行分离。此现象不应理解为SFC无法兼容流动相中的水、水性样品或许多生物样品。关于以水作为SFC流动相的组成部分,可参阅相关综述Z尽管认为SFC不适用于较大的生物分子（如蛋白质），但实验中已经洗脱出高达40聚体的肽必，而且，仅有一个氨基酸位置不同的肽异构体可在很短的时间内得到良好的分离23。这是一个活跃的研究领域，如果肽能够被洗脱出来，那么相比于HP1.C就有可能显著改善色谱分析速度。在SFC的早期
29、，大多数应用都涉及分离相对非极性的溶质，通常为同系物，例如硅油、表面活性剂、蜡质、脂类等分子量过高或热不稳定性过强而无法通过高温气相色谱（GC）进行分析的物质。大多数此类工作都使用纯C（k压力程序和火焰离子化检测器（FID）。这一状况在20世纪80年代后期慢慢改变，在首批手性SFC分离成果发表后，此改变尤为明显2426过去15年来，SFC已广泛应用于制药行业,用于快速洗脱似药物类小分子，尤其适用于手性分离。最近随着稳定性的改善，特别是随着UV灵敏度的提高，SFC开始重新扩展至更广泛的应用领域。SFC的应用领域与各种形式液相色谱的应用领域对比如图1.6所示。由图中可以看出，采用各种流动相组合的S
30、FC涵盖的应用范围几乎与各种形式的HP1.C完全相同，唯一未能明显涵盖的领域是离子色谱。SFC相对于HP1.C更适合哪些应用?SFC：纯C02SFC：C02和有机改性剂SFC：C02,改性剂,添加剂和水SFC：C02.改性剂，添加剂正相HP1.CHI1.IC反相HP1.C离子色谱离子对极性增加羟类和第类授类苯胺和苯甲酸脂肪酸和蜡羟基酸和多元酸伯胺类两性离子离子住白质IdnaRNA1.图1.6各种形式的SFC与HP1.C子设备类的应用领域对比.表明SFC基本涵盖了与HP1.C相同的应用范围1.3.1SFC中保留值特性正相SFC涉及溶质与极性固定相之间的极性-极性相互作用。空间位阻在SFC中非常重
31、要。同一分子内大部分被非极性基团包围的极性官能团容易导致该分子在极性固定相上的保留值大大减小（相比未受阻的极性官能团的分子而言）。例如，在同系物芳胺.二节胺和三节胺中，碱性履氮原子取代程度的增加而增加27。因此.三节胺的碱性和极性均强于二节胺，而二节胺的碱性和极性则依次强于节胺。在该同系物中，分子量也随着苯基取代数目的增加而增加。分子越大，则保留性趋于更强。如果极性和分子量为决定因素，则极性色谱柱上的洗脱顺序应当为芾胺、然后是二芾胺、最后三芾胺。然而，三千胺几乎未得到保留，二千胺的洗脱顺序排第二，而分子最小且碱性最弱的芳胺的保留性能最强。很明显.氮原子上增加的每个苯基取代基逐渐阻碍氮原子上的孤
32、电子对，接近极性固定相并与其发生相互作用。由于类似的原因，环中的氮原子容易与极性固定相发生弱相互作用，几乎不需要添加剂来获得良好的峰形。固定相的选择对分析速度具有重要影响,某些固定相的保留性能远强于另外一些。如果两种不同的固定相均可针对某一分析问题提供合理的解决方案，应优选采用较低浓度改性剂的解决方案，因为改性剂浓度越低,则粘度和色谱柱压降也会越低。1.3.21.ogP药物开发中广泛用于衡量亲脂性的指标是IogP,它是化合物在辛库与水之间分配系数（P）的对数值。辛醇是一种醇，其羟基头部具有中等极性,而C8骨架则是非极性的。辛醇与水不混溶，彼此接触时会形成两个不同的相态，目标化合物分子可选分隹地
33、分配于其中一个相态中。IogP为正表示药物优先分配于辛醇中，ogP为负则表示其优先分配于水中。1.aPinSki提出了一套有效的药物开发法则，称之为五现姊二其中一条规则称,要作为有效的口服药物，化合物的ogP应当介于0到5之间。当IogP为2.5时，相对于分配至水中的各个分子而言，将有300多种分子分配至极性较低的辛醇中。5000种市售药物的实际IogP值的分布如图1.7所示,其中表明绝大多数药物都介于-1到6之间，平均值大约为3.与1.iPinSki的建议值一致。ogP小于2到大于7范围内的溶质均可使用基于CO2的流动相进行洗脱和分离。因此，SFC非常适用于洗脱和分离似药物类小分子。展示的S
34、FC区域图1.75000种市售药物在辛制与水之间分配系数对数值1.ogP的曲线,图中表明绝大多数药物仅具有中等极性，非常适合采用SFC进行分析。过去的经验提出SFC不适用于需要水性缓冲环境的化合物，这一经验被误解为SFC仅适用于非极性溶质,这是不正确的。许多有机物在水中的溶解性非常差WgP远大于5）,这使得它们很难成为候选药物.因为它们会永久吸附到脂肪组织中而不会与相应的生物受体发生相互作用。药物开发中的一项重要工作是提高水溶性,从而降低化合物贮存在脂肪组织中的可能性。这点也可能被误解为建议似药物类分子必须极易溶于水（和生物体液）中。这种看法同样是不正确的。如果化合物水溶性过强.它们将很难作为
35、候选药物,因为它们会快速地排出体外。提高水溶性通常意味着仅从不溶提高至微溶。此类化合物可能在细胞中存留较长的时间，与相应的受体发生相互作用。因此，此类化合物被视作具有中等暗脂性或亲脂性。五规娜中的另外一条规则指出理想口服药物的分子量应当不大于500代图1.7展示了IogP为2甚至更低的几种药物。这些主要是蛋白质和大分子肽，它们因分子过大容易受到破坏而难以完整通过肠道，因此不适合口服，但是它们可进行注射。此类化合物基本上无法采用SFC进行分离。1.4这一名称的含义超临界中的前缀一超字通常会令人产生很多联想，这似乎表明越界时将会发生什么特殊的现象。然而，超仅仅是指之上而已。类似地，临界也很骇人，通
36、常会受到误解。临界点是指某个温度和压力点,超过该点后只会存在一种相态。超临界就是指超出临界点之上。超临界不可视为一种独立的物质状态。物质状态仅包括气态、液态、固态和等离子体态。超临界区属于过渡区，在这个区域中通过改变温度和压力可使气态转化为液态（反之亦然），而不是相临界点。选用超临界漪体色漕这个名称是令人遗憾的,因为它并未涵盖所有感兴趣的流体特性。所用的条件通常是亚临界状态,通常意味着压力高于临界压力但温度却低于临界温度。通常很难进行区分。当流体的定义改变时，保留值、密度.效率或线速度并不会发生突变。显然，作者并不愿使用一个技术上不妥的名称并错误地使用超临界一词。然而.强调流体并非处于超临界状
37、态会暗示这两种条件存在着根本的差异，这也是不正确的。这一混淆导致了许多不同名称的诞生.不过它们在本质上是相同的。在1957年一次气相色谱会议的公开讨论中，Jim1.ove1.ock提出使用压缩的无机气体（如SO?）作为流动相进行强极性物质色谱分离。他提出临界态色漕的名称，但并没有开展实验。他有一封至今尚存经过公证的1958年的信件，其中介绍了他的看法。ErnstK1.esper率先投入高压和高于其临界温度的流体作为色谱流动相加他使用氟碳流动相通过填充柱对吓咻进行分离。在有史以来的第一篇SFC论文中，他将其描述为高于肺界温度的高压中相色漕。大量论文中所用的温度均高于临界温度，尽管压力很高，却仍低
38、于临界压力。按照定义，该条件下的流体属于气体，该技术可称作（高压）气相色谱。然而，这一名称没有表达出该技术的性质。流体在此技术中充当溶剂,而在通常理解的气相色谱中，流动相只是惰性载体（即，并非溶剂）。1966年，Giddings发表了有美湍流气相色漕和超高压气相色漕的论文乳及。在多年后的另一篇论文中，他将名称改为高密度下相色漕以试图将该技术与常规GC区分开来，因为此技术中的流动相充当溶剂并且溶剂强度与密度成正比，有趣的是，后两篇论文均使用了高达2000个大气压的压力，这一压力大大高于如今称为超高效液相色谱的技术中所用的压力。1967年，Sie和RijnderS利率先将该技术称为超商界潦体色谱这
39、一名称好过将流体称作气体“，但暗示流体需要始终处于超临界状态才可表现出目标特性.这点是不正确的。1985年，Caude似乎已经提出亚临界流体色谱的名称35。按照定义,在高于临界压力但低于临界温度的条件下操作时流体从技术层面来说属于液体。然而，他们正确地推断出将其称为成体也容易产生混淆,因为该流体处于高度可压缩状态，需要采用特殊硬件（如泵）及有效提升和控制出口压力的方法。虽然术语亚I临界”继续得到广泛采用，但许多人似乎认为亚临界流体与超临界流体的特性之间确实存在显著差异。O1.esik自1991年起提出增强流动性磨漕的名称，成为一个独特的叫法36。她还洛我称作具有增强流动性的高效液相色谱.采用C
40、O?作为流动相的重要组成部分,但通常只占10至25%,在高压但低于临界温度的条件下操作。流体保留了SFC所固有的一些较高的扩散系数.低粘度等特性,但也保留了更多水性流体所固有的极性。增强流动性色谱是其他人称为亚斶界流体色谱的延续。两个研究组均认为,按照定义，如果流体并非处于超临界状态，那么它必然为液体或处于亚临界状态。如上文明确指出的，这些技术名称随时间不断地变化，其目的都在于试图阐明其中所涉及过程的本质。然而，这些新名称在某种程度上人为制造了边界或障碍，而这些边界或障碍并不具有实际的化学或色谱意义。将流体称作液体或气体并未完整把握到该技术的本质。称为流体超临界也不能很好地描述相关过程，因为按
41、照定义，该流体有时具有与亚临界相同的性质。所有这些名称试图描述的内容中有几个一致的方面。首先,采用流体作为溶剂，并且可通过改变组成和/或密度（温度和压力）调节溶剂强度C其次,流体处于高度可压缩状态，需要采用特殊的泵和维持较高出口压力的方法。无论流体在任何特定温度或压力下的定义如何.这两个方面都真正适用于所有感兴趣的流体。我希望说明的是所有这些名称描述的是同样的技术，并使用同样的硬件。奶缩溶剂色谭这个名称可能更好些，但现在要改变已经太晚了。我们已经有了太多的名称，只要采用Sg描述所有这些技术就足够了。流动相2.1为什么使用CO2?如今,几乎所有SFC应用中都采用经有机溶剂(有时是强极性添加剂)改
42、性的Co2。CO?作为优选流体是因为它： 方便易得 廉价 易达到临界点 相对安全 因可回收利用而被视作绿色流体，并且 能够与各种强极性改性剂混溶2.1.1可用性许多流体都曾用作SFC中的主要流体:这些流体包括一氧化二氮(N?0).卤代保.氨(NH3),二氧化硫(SO2)和超临界水。有些流体至今仍在使用。有些流体具有危险性(一氧化二氮、氨)。尽管有几种流体具有特殊的地位，但没有一种流体的总体性能接近Co2。全球饮料行业中使用了极大量的CO21相关配送设施完善，甚至覆盖到相对偏远的地区。原材料是许多其他行业的废弃物，这些因素相结合确保能够以极低的成本随时供应CO2。2.1.2成本配备多台SFC仪器
43、的机构或执行重要半制备型SFC分离的用户通常会安装贮罐。此类贮罐可容纳数吨CO2,通常由大型罐车进行补给。在该规模下.C0?成本仅为大约0.10美元/升。杜瓦瓶和不锈钢瓶装的成本则大约为1.00美元/升。几乎所有增加的成本都源于额外的处理费用，但其成本仍然大大低于最常用的溶剂。2.1.3纯度SFC级CO2在20世纪80年代后期到90年代初期开发出来，为新兴的SFC业务提供了高纯度流动相。此产品的推出顺应了当时的需求，因为订购市售工业级CO2钢瓶气时，送到的气瓶中往往会填充有少量玉米油(作者的亲身经验！)。另外，饮料行业中所用的C02不锈钢瓶有时会重新填充水或过期啤酒,导致不锈钢氧化生成胶态铁颗
44、粒，这些胶态铁颗粒对色谱性能具有不利影响且很难清除。当时一般采用汲取管从钢瓶底部吸取液态COz以最大程度减少所需的冷却功率。这意味着溶解在CO2中的所有物质都将伤害到色谱仪。20世纪80年代后期，这些负面的经验促使人们开发出ASTM认证的保证纯度的SFC级CO26这些产品至今仍在售。它通常以30磅铝制气瓶的形式运输，成本为大约20美元/升，这也使SFC操作成本的优势失效。此产品与其他等级产品的主要差别在于.每批次均经过纯度测试并出具分析证书以表明其符合特定的标准。当前可能除超痕量工作以外，似乎没有必要再购买此等级的产品。散装CO2通常具有高纯度。大多数污染发生在流体重新包装到较小容器的过程中。
45、如今供应状况已得到大大改善,高纯度工业级产品通常即可满足要求。许多等级产品均为纯度高于99.99%的CO2,饮料或食品级产品为便捷、安全的选择。应当指出，安捷伦分析型SFC系统配备有强大的冷却器，具有使气瓶中的蒸汽液化的独特功能。因此，不需要使用由阀门延伸到气瓶底部上方的排放管或汲取管。通过使用气相而非液相（流体会在使用前蒸得）.任何不挥发性污染物都会被留在气瓶中。2.1.4易达到临界点2.1.5安全性2.1.5.1CO2的毒性纯CO2的临界点在31和70bar以上的条件下即可轻松达到。这就意味着CO2能够在相对较低的温度和压力下压缩成高密度流体。处于相对较低温度下的高密度溶剂不易破坏温度敏感
46、的不稳定化合物。只需适中的压力即可轻松获得高密度溶剂，不会带来显著的技术障碍和能源损耗。C02是人类呼吸产物之一，正因如此，低浓度条件下没有毒性。然而，高浓度二氧化碳可致命。人们不需要对实验室中的C02过度紧张。许多便利店、餐厅和咖啡馆都具有与其软饮机配套的高压C0?气瓶。许多灭火器中也包含高压C02,并且广泛分布于工厂和办公楼中。SFC实验室中的COz浓度经过精心计算，远低于会议室或影剧院中的常见浓度。实验室中很少直接储存大量CO2.因此不大可能发生大规模泄漏。CO2的密度大于空气，在通风不良的空间内易于积聚在地板附近。传感器和警报器应安装于靠近腰部高度处。氧气传感器无法提供所需的信息,因为在任何潜在危险的状况下，即使C02处于危险水平时，氧气含量也可能
