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1、阿苯达嗖抑制P糖蛋白表达对耐顺钳卵巢癌细胞耐药性的影响研究何迎盈1,刘娜娜I,罗治彬2,李少林】(1.重庆医科大学基础医学院核医学教研室，400016：2.重庆市合川区人民医院肿病血液科，401520)摘要目的：研究阿苯达嘤(a1.bendazo1.e,ABZ)通过抑制人耐顺销卵巢癌SKOV-3/DDP细胞P-糖蛋白(Pg1.ycoprotein,P-gp)的表达对细胞耐药性的影响。方法：在体外，用澳化二甲嚷噗二苯四氨噗(MTT)比色法检测ABZ对SKoVMDDP细胞增殖的影响，求得抑制率为0%、25%、50%、75%所对应的ABZ浓度，并按抑制率将实验分为对照组，25%抑制浓度(0s)组、半
2、数抑制浓度(ICSO)组和75%抑制浓度(IC75)组，每组给予相应浓度的ABZ处理，并按作用时间再将每组分为12h、24h、36h亚组。按组用ABZ处理细胞，在12h、24h、36h分别用流式细胞仪检测各组细胞表面P糖蛋白(P-g1.yCoProtein,P-gp)的表达。将不同浓度的顺柏(cisp1.atin,DDP)、表阿霉素Cepirubicin,EPI)5-氟尿口密咤(5-f1.uorouraci1.,5-Fu)按照分组，联合和序贯ABZ处理细胞后，采用MTT比色法检测SKoVuDDP细胞体外增殖情况。结果：ABZ作用SKoV夕DDP细胞后使P-gp表达卜降，呈浓度和时间依赖性。联合
3、利序贯ABZ,均能降低DDP、EP1.和S-Fu对SKOVmDDP细胞的作用浓度，有浓度和时间依赖性，且联合作用优于序贯作用。结论：ABZ能在体外通过抑制SKoV-夕DDP细胞P-gp表达提高细胞对DDP、EPI、5Fu的敏感性，并能逆转细胞的耐药性。关键词：阿苯达嚏P糖蛋白耐药性EffectofA1.bendazo1.eonChemoresistancebyInhibitingP-g1.ycoproteinExpressionofCisp1.atin-resistantOvarianCancerCe1.1.sAbstractObjective:Toinvestigatetheeffectof
4、a1.bendazo1.e(ABZ)onthechemoresistancebyinhibitingP-g1.ycoprotein(P-gp)ofhumancisp1.atin-resistantovariancancerSKOVyDDPce1.1.s.Method:Invitro,effectofABZonpro1.iferationofA549DDPce1.1.swasdetectedbymethy1.thiazo1.y1.tetrazo1.ium(MTT)co1.orimetry,thenaccordingtoinhibitionconcentrations(IC)of0%,25%,50
5、%z75%todevidece1.1.sinto4groupscontro1.groupzIC25groupzIC50groupxIC75groupzmoreover,basedonABZactiontimetoinvideeverygroupinto12h,24hand36hsub-groups.Atthesettingpointsofactiontime,theP-gpexpressionofeachgroupwasdeterminedbyf1.owcytometry.Thepro1.iferationofSKoVTDDPce1.1.swasdetectedbyMTTco1.orimetr
6、yaftertreatmentwithABZcombinedandsequencewithDDEEPI,5Fu.Resu1.ts：AftertreatmentwithABZ,theexpressionofP-gpdecreasedinadose-andtime-dependentcombinedandsequencewithABZcandecreaseactionconcentrationofDDPzEPIandS-FutoSKoVTDDPce1.1.s,inadose-andtime-dependentmanner,moreover,theeffectofcombinedwasbettert
7、hansequence.Conc1.usion:ABZcou1.ddown-regu1.atetheexpressionofP-gpandincreasethesensitivityofSKoV3DDPce1.1.stoDDP,EPI,5-Fu,andreversethever.Keyword：a1.bendazo1.e,P-g1.ycoprotein,chemoresistance卵巢癌是病死率最高的妇科肿瘤，且发病率和病死率逐年上升1。虽然手术与化疗提高了五年生存率，但耐药仍是治疗所面临的难题2,且常表现为多药耐药(mu1.tidrugresistance,MDR)多数学者认为耐药卵巢癌细
8、胞高表达P糖蛋白(P-g1.ycoprotein,P-gp)3介导了卵巢癌的多要MDR4。阿苯达喋属于苯并咪嗖类(bcnzimidazo1.carbamate,BZS)抗寄生虫药物，安全低毒，至今仍在使用。国外研究发现，它可以通过抑制肿瘤细胞微管蛋臼聚合5,诱出以CaSPaSe和细胞色素C释放的凋亡，耐紫杉醇的白血病细胞CEMdEpoB300和卵巢癌细胞1A9PTX227却通讯作者,罗治彬，Te1.:,E-mai1.：对ABZ敏感。但ABZ是否能够抑制P-gp表达从而影响耐药肿瘤细胞的耐药性，目前，国内外无文献报道，是本实验研究出发点。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系人耐顺的卵巢癌
9、SKoV-歹DDP细胞株购买于中国医学科学院肿瘤细胞库。1.1.2 主要试剂及仪器胎牛血清RMPI1640培养基购自Gibco公司ABZ购自AccuStandard公司，纯度为97.5%。MTT和二甲基亚网DMSo)购自Sigma公司。顺伯(cisp1.atin,DDP)注射液购自南京制药厂。氟尿嗑咤注射液(f1.uorouraci1.,5-Fu)购自上海旭东海普药业。盐酸表柔比星(epirubicin,EPD购自浙江海正药业。P-gp抗体(货号：557003)、同型异构体(货号：555743)购自BD公司，FACSCa1.ibUr流式细胞仪为美国BD公司产品。1.2 方法1.2.1 实验分组
10、SKOV-VDDp细胞按IX1.O=孔的密度接种于96孔板，加入含终浓度为1、2、4、8、16、32、64、128UmOI/1.的含ABZ培养液。每个浓度设3个复孔。培养24h后，加入5mgm1.MTT201.,4h后，加入1501.DMSO,酶标仪49Onm处测定吸光OD值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率()=(1-(实验孔OD值一空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值一空白对照孔OD值)X100%.按照实验结果，将实验分为对照组、25%抑制浓度(IC25)组、半数抑制浓度(ICso)组和75%抑制浓度(IC75)组。1.2.2 流式细胞术测SKOVaDDP细胞表面P-gp的表达SKOV-y
11、DDP细胞按IXIo6/孔的密度接种于6孔板，加入培养基孵育过夜。待细胞贴壁后，按组分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0mo1.1.ABZ的培养液,在12h、24h、36h时用胰酶消化并收集细胞，PBS轻洗2次，室温IOoorPm离心3min,弃去上清液。避光条件卜,空白孔加入201.PBS,同型对照孔加入同型对照抗体201.,对照组和实验组均加入P-gp抗体201.避光室温孵育Ih,每20min轻轻熊荡Imirb最后加入PBS至300P1.,上机检测。1.2.3 ABZ影响SKoV夕DDP细胞对DDP、EPI、S-Fu的敏感性SKoVaDDP细胞按1IO4/孔的密度接种于96孔板，培养
12、过夜。将DDP、EPkS-Fu分别溶于含0、1.5、8.0、50.0mo1./1.ABZ的培养液中，使DDP和S-Fu终浓度为5、10、20、40、80、160、320、640mo1.1.,EP1.终浓度为3.5、7、14、28、56、112、224、448HmOI/1.0待细胞贴壁后，小心吸去孔内培养基，按照分组，将配好的药液加到试验孔内，每个浓度设3个复孔。培养24h后，按照1.2.1所述方法行MTT法检测并计算细胞增殖抑制率。1.2.4 ABZ影响SKOV-歹DDP细胞对DDP、EP1.5Fu的耐药性SKOV3DDP细胞按1X10，/孔的密度接种96孔板，培养过夜。待细胞贴壁后，小心吸去
13、孔内培养基，按组分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0mo1./1.ABZ的血清培养基。培养12h后，小心吸去孔内培养基，无菌PBS轻洗两遍，再每孔加入血清培养基培养24h,再吸去孔内培养基，按组分别加入含DDP.EPk5Fu的血清培养基。DDP和5Fu的终浓度为5、10、20、40、80、160、320、640mo1./1.,EP1.终浓度为3.5、7、14、28、56、112、224、448mo1./1.o每个浓度设3个复孔。培养24h后，按照1.2.1所述方法行MTT法检测并计算细胞增殖抑制率。13统计学方法以上步骤均重复3次，所得数据采用SPSS18.0软件进行分析，结果采用5表示
14、，样本均数差别的多重比较采用单因素多水平1.SD法方差分析，以P(33.153.94)mo1./1.因此对照组、5组、ICSo组和ICTS组所对应的ABZ作用浓度分别为:0.0、1.0、5.5、35.0mo1./1.,再按ABZ作用时间将各组分为12、24、36h3个亚组，以便横向比较。2.2 SKOVVDDP细胞膜上P-gp表达经过CeIIQuest软件拟合得出各组细胞膜上P-gp的表达，从浓度和时间依赖性两方面分析ABZ对P-gp表达的影响(表1)。ABZ作用于SKOVyDDP细胞后，实验组的P-gp表达明显下降。12h时，IC25组和IC50组P-gp表达无明显差异。24h和36h时，各
15、实验组间P-gp表达差异明显。结果说明，ABZ能够明显抑制SKOV歹DDP细胞P-gp表达，并在24h和36h时有浓度依赖性（图1、2、3）。另外，相同浓度的ABZ作用不同时间，Pgp表达都具有明显的差异性，说明ABZ抑制Pgp表达还具有时间依赖性。表1ABZ对SKoV歹DDP细胞膜上P-gp表达的影响（.Hs,%）12h(%)24h(%)36h(%)对照组94.463.2295.264.0994.401.83IC25组88.042.55a53.163.50a20.952.61aIC50组83.343.76a32.471.7Iahd10.521.48aeIC75组61.263.22ac18.8
16、32.35ahc,d4.420.62abc,d,ea:P0.05,与同一时间对照组比较；b:P0.05,与同时间5组比较；c:P0.05,与同时间IC50组比较1d:P0.05,与同组内12h时比较；e：P0.05,与同组内24h时比较。图1ABZ作用12h后各组细胞的P-gp表达b1.ankSv =OZ HoSS-v口骂g8Sp = 5SSdui/12h,Io408i S OWSS图2ABZ作用24h后各组细胞的P-gp表达5Ooo-s8ggOOboOZo xIC254r000-008 009 寻耳 O x8.62p3-O-OOm OS O=9 1.8Zo H-XSOoo-OOOe写 OoZ
17、 = 5IC2536h101?1?OOo-008 i 目 OOZoH-XS2.3ABZ影响SKOVyDDP细胞敏感性用SPSS18.0行回归分析，求得DDP.EPI和S-Fu联合ABZ对SK0V3/DDP细胞增殖抑制率分别为25%、50%、75%所对应的DDP、EPI和S-Fu的浓度，以IC25*XXIC5OXXXIC75-xxx表示（表2）。DDP、EP1.和5-Fu联合ABZ作用细胞后，实验组细胞对上述三种化疗药物敏感性均明显提高，且ABZ浓度越高，DDP、EP1.和5Fu的作用浓度越低，结果说明，ABZ能够降低DDP、EPI和5Fu对SKoVaDDP细胞的作用浓度，且具有浓度依赖性。表2
18、ABZ影响SKOV夕DDP细胞对DDP、EPI、5-Fu敏感性（王s,mo1.1.）药物浓度(mo1.1.)对照组IC25组IC50组IC75组DDPIC2533.552.053.490.1.0a0.380.06ab0.000.00a,b,cIC50363.501.8.6268.023.1.3a7.390.66a*b0.050.01.a,b,cIC753938.571.62.71.!329.071.40.51.aI44.433.91.9.81.0.50a,ba,b,cEPIIC2545.172.259.950.73a0.140.0030.000.00a,b,cIC50625.0343.8420
19、5.735.73a4.040.08ab0.070.01a,b,cIC758650.78785.414282.63536.47a115.382.44a,b8.180.82a,b,c5-FuIC25107.782.3757.822.99a8.300.20a*b0.020.01a,b,cIC502534.20112.481162.5193.93a63.421.45a,b0.810.13a,b,cIC7559607.693993.7223388.752592.36a484.3211.01a,b39.941.63a,b,ca:P0.05,与相应对照组比较；b:P0.05,与5组比较；c:P0.05,与Q
20、o组比较2.3ABZ影响SKOv-VDDP细胞的耐药性用SPSS18.0行回归分析，求得DDPsEPI和S-Fu序贯ABZ对SKOV岁DDP细胞体外增殖抑制率分别为25%、50%、75%所对应的DDP、EP1.和5-Fu的浓度，以IC25-xxxIC50-xxx、IC75-xxx表示（表3）。ABZ序贯DDP、EP1.和5-Fu作用细胞后，实验组细胞对上述三种化疗药物耐药性均明显降低：越高浓度的ABZ可使DDP、EP1.和5-Fu对细胞的作用浓度越低，结果说明,ABZ能够逆转SKOVTDDP细胞对DDP、EPI和5-Fu的耐药性且呈浓度依赖性。表3ABZ影响SKOV歹DDP细胞对DDP、EPk
21、5-Fu的耐药性（日土5,mo1.1.）药物浓度(mo1.1.)对照组IC25组IC50组IC75组DDPIC2533.031.0812.930.99a2.120.83a*b0.510.05a,b,cIC50365.4116.6095.863.49a38.852.03a*b10.000.61a,b,cIC754043.08238.10711.564.76a618.0355.51a,b196.907.65a,b,cEPIIC2544.862.0321.030.47a8.240.283fb0.080.01a,b,cIC50627.2938.71290.4214.81a79.181.77a*b2.9
22、220.20a,b,cIC758772.55687.894012.34319.87a762.2561.10a,b103.282.53a,b,c5-FuIC25105.592.1782.971.84a16.970.77a*b0.390.04a,b,cIC502479.65108.701471.1270.05a141.798.78a,b9.170.40a,b,cIC7558290.494638.5126125.322418.85a1185.0094.57a,b214.6814.34a,b,ca:P0.05,与相应对照组比较；b:P0.05,与IC25组比较；PCO.05,与心。组比较2.4增敏和逆
23、转效应比较将DDP、EPI、5-Fu联合ABZ时在抑制率分别为25%、50%、75%所对应的浓度与ABZ序贯DDP、EPK5-Fu相对应的浓度对比后发现，IC25浓度ABZ联合和序贯EPI、5-Fu对细胞的敏感性和耐药性改变无明显差别，IC50、IC75的ABZ都表现了联合作用优于序贯作用，即ABZ增敏效果强于逆转效果。3讨论阿苯达嗖是临床上至今仍在使用的抗寄生虫药物,它通过抑制寄生虫肠细胞摄取葡萄糖抑制糖酹解相关酶活性，阻止三磷酸腺甘产生，耗竭糖原使虫体无法生存和繁殖8。1985年1.aCCy和IVaStOn发现BZS可抑制小鼠白血病细胞1.1210生长9后，国外学者对BZS抗肿瘤效应进行了
24、不少的研究，并证实了ABZ通过抑制微管蛋白聚合有抗肿瘤作用，抑制乏氧诱导因子(hypoxia-inducib1.efactor-1,HIF)】。和血管内皮生在因子(VaSCU1.arendothe1.ia1.growthfactor,VEGF)1】表达，改善乏氧和血管形成等。顺伯是卵巢癌化疗的一线用药，疗效明显且价格便宜，但治疗后期常产生耐药】2,多表现为MDR”P-gp由MDR1.和MDR3基因指导，定位于细胞膜，是依赖ATP的药物外排泵，它通过将药物泵出胞膜外而降低胞内药物浓度而导致耐药巴目前普遍认为耐药的产生与Pgp高表达有密切关系，另外，P-gp高表达可能也会影响细胞的凋亡叽通过抑制P
25、gp的功能可逆转耐药细胞的化疗抵抗性巩我们的实验发现,ABZ通过抑制Pgp表达，不仅提高了SKoV歹DDP细胞对DDP、EPI、5Fu的敏感性，还逆转了细胞对这三种药物的耐药性，且增敏作用优于逆转作用。现在使用的绝大多数的化疗药物毒副反应很大，以至于许多患者不能耐受，或死于化疗药物毒性。ABZ有很高的临床安全性，研究发现，它具有卓越抗肿瘤效果，即使对耐药细胞的效果也很明显，希望经过深入研究后，它能够应用于肿痛临床化疗中，改善耐药细胞的耐药性，提高患者生存率。1 Siege1.RzNaishadhamDzJema1.A.CancerStatistics,2012.CACancerJC1.in.2
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