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1、霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的基因组流行病学分析霍氏肠杆菌霍夫曼亚种(EnterObaCterhormaecheisubsp.hoffmannii)是一种机会性感染病原体，属于阴沟肠杆菌复合体(EnterObaCtercIoacaecompIex,ECC),可导致多种感染，如肺炎、尿路感染和败血症等1o近期有研究提出将其单独作为肠杆菌属下的种进行分类，进一步提高了其分类学地位2o霍氏肠杆菌霍夫曼亚种可低水平表达可诱导A叩C头匏菌素酶，因而对青霉素和一、二代头匏菌素具有天然抗性。霍氏肠杆菌霍夫曼亚种易获得多种超广谱B内酰胺酶(extended-spectrum-lactamase,ESB1.)和碳青霉烯
2、耐药基因，如blalMP-26、blaSHV778和blaKHMT等，导致其耐药性增强，增加了临床抗感染治疗的难度3,4o对全球临床分离的产碳青霉烯酶肠杆菌属进行调查发现，最常见的碳青霉烯酶是VlM,其次是NDM、KPC.0XA-48和IMP,并发现了4个全球流行的克隆(STIl4、ST93、ST90和ST78)5oST66、ST78和ST114被证明与CTX-M75的传播有关6oECC中碳青霉烯酶的流行具有明显的区域性特征，北美以KPC和IMl为主，欧洲和中东以OXA-48和VIM为主，而中国和东南亚则以NDM和IMP为主1,7oST171是在美国流行的主要耐碳青霉烯阴沟肠杆菌(carbap
3、enem-resistantEnterobactercIoacae,CREC)克隆，主要与blaKPC-3相关。而在ST78分离株中检测到多种碳青霉烯酶(blaVIM-1.blalMP-1.bIaIMP-4,bIaIMP-8、blaOXA-48),存在于多种不同质粒上，包括InCHI2、IncW和InCFIB等5,8,说明了ST78克隆耐药模式的复杂性和多变性。碳青霉烯耐药质粒在不同克隆和细菌物种间的水平转移是碳青霉烯类耐药基因广泛传播的重要原因。对携带碳青霉烯酶基因的质粒进行详细分析有助于了解耐药基因的获取机制，对霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的基因组流行病学调查有助于监测其流行、进化和耐药情况，指导
4、临床针对性用药和预防措施的制定。材料与方法一、材料1.菌株来源：收集2014年8月至2021年8月中山大学附属第一医院分离的耐碳青霉烯阴沟肠杆菌复合体(CRECcomplex,CRECC),并将其分为重症监护室(intensivecareunit,ICU)组和非ICU组。同一患者多次分离的菌株只收集第一次分离的菌株。抗菌药物体外敏感试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853o接合试验受体菌为大肠埃希菌(E.coli)J53o本研究为回顾性研究，所有临床数据均为匿名，经中山大学附属第一医院伦理审查委员会批准豁免知情同意申请书（批件号：伦审2019483号）。2 .
5、仪器与试剂：VlTEK基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matri-assistedIaserdesorption/ionizationtimeoffIightmassspectrometry,MA1.DI-TOFMS）（法国BioMerieux公司）；VeritiPCR扩增仪（美国ABl公司）；DIYY-6C水平电泳仪（北京六一仪器厂）；GS710凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）；SysmexUF-1000i自动尿液分析仪（德国SiemenS公司）；M-H琼脂（英国OXOid公司）；PCR反应试剂盒（日本TakaRa公司）;DNA标准带D1.2000（日本TakaRa公司）；Mini
6、BEST细菌基因组DNA提取试剂盒（日本TakaRa公司）；IlluminaNextSeq500高通量测序仪（美国IllUmina公司）。二、方法1.菌株鉴定和流行情况调查：使用VlTEKMA1.DI-TOFMS和16SrRNASanger测序进行菌种鉴定。匿名收集CRECC感染患者的年龄、科室、性别等信息。3 .药敏试验：使用微量肉汤稀释法对亚胺培南、厄他培南、哌拉西林/他喳巴坦、头施曲松、头抱他噫、头孑包毗脑、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素，阿米卡星和复方磺胺甲.喳的最低抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）进行检测。根据美国临床
7、和实验室标准化协会M100-S30标准判断药敏试验结果9。大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。4 .耐药基因检测：采用PCR法检测8种B内酰胺酶耐药基因，分别为5种碳青霉烯酶基因blaKPC、bIaNDM.blalMP.9 种PMQR基因qnrAqnrBqnrCqnrD、qnrSqepAoqxAOqXB和aac(6,)Tb-Cro引物序列和反应条件参考文献10 0o采用煮沸法提取细菌DNA模板。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，对阳性扩增产物进行一代测序，使用在线B1.AST(https:/blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
8、对测序结果进行比对。4 .接合试验：将相同数量(1107CFU/mI,使用SySmeXUFTOOOiTM自动尿液分析仪计数)的对数期供体菌C37和受体菌E.coliJ53(叠氮化钠耐药)在200I1.B肉汤中混合。在37下接合6h后，将20I混合培养物涂在含有1mg/1.美罗培南和100mg/1.叠氮化钠的1.B琼脂上。接合频率为接合子数量除以供体菌数量11o所有试验重复3次。并对接合子进行菌种鉴定、药敏试验和耐药基因检测。5 .全基因组测序：使用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒提取C37菌株的基因组DNA。使用IIIuminaNextSeqSOO高通量测序仪进行全基因组测序，测序模
9、式为双端测序(PE150)o使用FaStPv.12.5过滤双端原始读数，使用Unicyclerv.4.9b进行从头组装，并使用PrOkkav1.14.6进行注释12,13,14。耐药基因和质粒类型由ABRiCatev.8.13(https:/从NCBIassembly数据库中下载目前公开的霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的基因组序列。使用ParSnPv1.5.615提取其核心基因组，并构建系统发育树。基于ParSnPv1.5.6提供的核心基因组单核甘酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)比对，使用rhierBAPSv1.0.1鉴定种群结构16o使用PUbM1.ST(h
10、ttps：/pubmlst.org/organisms)数据库鉴定霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的M1.ST型别。使用GrapeTree17可视化M1.ST型别，使用geoBURST18分析种群克隆复合体(CIOnalcompIex,COo6 .数据可用性：将C37菌株的基因组序列提交至NCBl的ASSembly数据库，获得序列登录号(GCA_019448495.1)。将pNDM-1-C37质粒序列提交至GenBank核酸数据库，获得序列登录号(MZ667211.1)o7 .统计学分析：使用SPSS19.0(IBM公司，美国)进行统计分析。采用X2检验对重症监护室(intensivecareunit,I
11、CU)和非ICU分离的CRECC菌株的标本来源、性别分布和耐药率进行统计分析。采用t检验对ICU和非ICU分离的CRECC菌株的平均年龄进行统计分析。P0.05被认为具有统计学意义。结果一、临床特征本研究共收集了155株CRECC,其中ICU来源53株，非ICU来源102株。IeU分离的53株CRECC,主要来自痰(16/53,30.2%)、引流液(14/53,26.4%)和血液(5/53,9.4%)等标本，而非ICU分离的102株CRECC,主要来自尿液(23/102,22.5%)、胆汁(17/102,16.7%)和引流液(20/102,19.6%)等标本，标本来源差异有统计学意义(2=20
12、.4,P0.05),且ICU组和非ICU组的性别分布差异无统计学意义(2=0.4,P0.05)由于临床菌株鉴定方法学的限制，目前临床上霍氏肠杆菌常常被鉴定为ECCo在53株ICU分离的ECC菌株中，有1株编号为C37的菌株经16SrRNASanger测序鉴定为霍氏肠杆菌霍夫曼亚种。C37菌株分离自患者的痰标本。该患者被诊断为特重型颅脑外伤性意识障碍，并发肺部、尿路和颅内感染，既往存在梅毒感染史，并且在该患者的痰标本中曾多次检出铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。C37菌株在血平板上呈现为光滑湿润、中等大小的白色菌落(图1A),革兰染色显示其为短杆状革兰阴性杆菌(图IB)o注：1A为C37前株的血平板菌
13、落形态图；IB为C37菌株的革兰染色形态图图1C37菌株的形态学结果二、药敏试验和耐药基因检测结果155株CRECC对头匏哌酮/舒巴坦、头施曲松、头把他唉和氨曲南等大部分0内酰胺类抗菌药物的耐药率超过60%,而对阿米卡星、替加环素和多黏菌素B等抗菌药物较为敏感，耐药率低于10%。结果见表1。ICU分离的CRECC对亚胺培南(2=5.9,P0.05)、头把毗脑(X2=5.9,P0.05)、替加环素(X2=4.5,P0.05)和复方磺胺甲喳(X2=7.8,Pmph(A)、ant(3,)Ta、ARR-3catB3catB4和SUl1,解释了其多重耐药的原因。C37菌株携带InCX3、InCX4、In
14、CFlB和IncFII质粒。三、接合试验碳青霉烯类抗性基因blaNDM7可以成功地从C37菌株转移到E.coliJ53中。blaNDM7质粒的接合频率为(3.45.6)X10-5/供体细胞。药敏试验结果表明接合子C37-E.coliJ53对美罗培南耐药，并检测到接合子C37-E.coliJ53中含有bIaNDMT。C37菌株与E.coliJ53的接合试验结果见图2o图2C37菌株与大肠埃希菌J53的接合试验结果图四、blaNDM7的遗传特征全基因组测序结果显示霍氏肠杆菌霍夫曼亚种C37菌株的bIaNDM-I存在于InCX3质粒PNDM7-C37上（图3）。对不同质粒类型来源的blaNDM7的遗
15、传特征进行比较，发现了一个保守的结构5-1SAba125-bIaNDM-1-bIeMB1.-3,在插入序列ISCR家族的帮助下，可以发生水平转移，而不再需要Tn125样转座子结构，提示blaNDM7的传播与5-ISAba125-bIaNDM-1-bIeMB1.-3,保守结构密切相关。pRpNDMl-l,IncH穗扬劳特氏图pEcNDMl,IncN大肠埃希88pKO.NDMl,IncFll-RBR酸克雷伯氏的pNDM-1C37,IncX3氏崎杆夫亚附pNDM-HN380,IC3肺炎克富伯pNDM-HK,InclM大肠埃福的pKpANDM-1,unkow肺炎克雷伯也注：头霹访有巳如放河丽S色）,僧
16、设蜜白（灰色）.WaNDM-1（红色）、具假药因牌红色）JSAba125（黄色）,ISCR东籁（绿色）、根6（深g）如其他IS元素（Mft）.Ift医示运弛质检之间的保守序列.各序列Gen6an呆号从HF依次为：JXSlSS88rJX46933,JQ3144O7,MZ667211.1.JXl（M760.NC,019065IOFN3%876图3来源于不同质粒类型的blaNDM7遗传特征结构示意图五、霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的系统发育树全基因测序结果显示C37菌株属于ECCST78型。对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种（包括C37菌株）的基因组进行系统发育分析，得到15个直系同源进化支。基于
17、贝叶斯推断的群体结构分析（BayesianpopuIationstructureanalysis,BAPS）显示有6个不同的群体（图4）。66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种菌株分属于12个ECC克隆复合体（图5）。在中国流行的主要M1.ST型别为ST278、ST78和ST97（图4）。ST78和ST601仅具有一个M1.ST等位基因的差异（SingIeIocusvariants,S1.V）,同属于BAPS种群2和ECC克隆复合体3（CC3）oST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种已在全球多个国家分离，包括中国、美国、尼日利亚、日本、西班牙、意大利和希腊（图4）,分离时间散布在2010至2020年（图5）,提示
18、其具有广泛的时间和空间流行性。值得注意的是，多株ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种被识别为产碳青霉烯酶霍氏肠杆菌霍夫曼亚种（carbapenemase-producingEnterobacterhormaecheisubsp.hoffmannii,CPEHH）,携带了多种碳青霉烯耐药基因,包括blaKPC、blaVIM.bIaIMP-8.blaOXA-48,blaNDM-1和blaKHM70ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因的传播密切相关。9ims加 ；SfiMtkV 9co AM B* BVu* 尼日利亚bv mb BX5f wx 黄CD注：tM示了第个进化w点内的IBnfigtt
19、aJRjra分比.IW发育忸叶田的Mtws朝代了昌.株的贝叶斯解体蜡两分析IS里.r惇了产破胃金的杆.夫曼亚冲.皖发商即t1的色尔枪住了M1.STS别.瑟色实心方16代装存在对应耐F因.本研究分啻的C37BB株使用红色虎缉6标记图4霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的系统发育树和耐药基因图分离时间201926128missing(72015(6.20185.201042020142014(3).200922011(220132201722005(1)Q2016(1ST278注：每个是一个节点大小JR决于该节点内的IWM1.在BMt旁标注了M1.ST型别,并且IBBB9Mli色与所MeC相对应.短条法耽T分支
20、，OSEKflrtIINiS)的18传距离而变化.国右*)的数字代表了各差株的分1年份.使用ECe的M1.STm停炽期K氏崎杆1B.夫景亚RegMlSTHJMtOCC(S1.V*)图5霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的群体结构图ECC是临床常见的病原体，并且是第二常见的耐碳青霉饰肠杆菌科细菌，而ECCST78型是全球多重耐药或碳青霉烯类耐药菌株中最常见的克隆之一1。霍氏肠杆菌霍夫曼亚种是常见的ECC分离株，但过去由于分类不清，对其研究相对较少1,19o近期有研究提出将其单独作为肠杆菌属下的种进行分类，进一步提高了其分类学地位2o最近，在ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种中检测到了blalMP-26和blaKH
21、M7等碳青霉烯基因3,4,引起了人们对CPEHH的关注。本研究发现了1株多重耐药CPEHH菌株C37,其携带了可接合转移的碳青霉烯耐药InCX3质粒pNDM-1-C37o碳青霉烯类抗性基因blaNDM7的水平传播可对全世界的公共卫生构成威胁。2009年，瑞典分离出携带blaNDM7的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株，该菌株对除黏菌素和替加环素外的几乎所有抗菌药物都具有耐药性20o此后，bIaNDMT很快广泛传播到全球多个国家，并扩散到多个细菌种属21。本研究报道了1例在霍氏肠杆菌霍夫曼亚种C37菌株中携带bIaNDM-I的InCX3质粒。本研究的结果拓展了bIaNDM-I传播的种属范围。InCX3质
22、粒已成为传播blaNDM7的主要流行质粒22oblast结果显示PNDM7-C37和在中国发现的blaNDM-1InCX3阳性质粒PNDM-HN3粒（GenBank登录号：JX104760,分离自肺炎克雷伯菌）及1例blaNDM-1IncFII-FIB阳性质粒PKoX_NDM1（GenBank登录号：JQ314407,分离自催产克雷伯菌）共享了5f-1SAba125-bIaNDM-I-bIeMB1.-trpF-dsbC-cutA1-groS-gro1.-3,的Tnl25样转座子的同源序列。追溯bIaNDMT的起源时，发现鲍曼不动杆菌的染色体上携带了Tn125转座子，其两端皆含插入序列ISAba
23、I2523。而在肠杆菌科菌中，blaNDM7周围常常只含有截短的单拷贝ISAbal25,截短的ISAbaI25序列提示质粒上的blaNDM-1可能最初来源于鲍曼不动杆菌染色体上的blaNDM-1o分析不同质粒类型来源的blaNDM7周围序列时，发现一个保守结构5,TSAba守5-bIaNDMT-bIeMB1.T,提示这个保守结构与blaNDM7的传播密切相关。2010年分离的产酸克雷伯菌E718含有两个质粒，InCA/CTncH型质粒pK0X-R1（GenBank登录号:CPOO3684）和携带blaNDM7的IncFII-FIB型质粒PKoX_NDM1（GenBank登录号：JQ314407
24、）24o而同样于2010年从1例患者血标本中分离的植物劳特菌KPNDMl中的InCH型质粒PRPNDM17（GenBank登录号JX515588）与PKOX-R1共享86%的序列长度，并且与pK0X_NDM1共享携带5,-ISAba125-bIaNDMT-bIeMB1.T的100%相同片段（1294bp）,说明PRPNDM17质粒的形成可能经过了复杂的重组。并且，pRpNDM1-1中5,-ISAba125-bIaNDMT-bleMB1.-3,片段嵌入了ISCR1复合体1类整合子中，这个bIaNDM-I-ISCRI元件(4812bp)能够自我切除，并被发现转移至了从同一患者粪便标本分离的大肠埃希
25、菌中的InCN型质粒PECNDMl(GenBank登录号：JX469383)上21o2014年我国学者在对14株blaNDM-1阳性的肺炎克雷伯菌中检测发现ISAba125-bIaNDM-I片段均为阳性25。这些结果充分说明5-1SAba125-bIaNDM-1-bIeMB1.-3,保守结构是bIaNDMT传播的关键结构。目前，可公开获得的全球霍氏肠杆菌霍夫曼亚种基因组分属于12个ECC克隆复合体，具有6个基于贝叶斯推断的种群结构。分析目前公开的霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的基因组时发现，有15株ST278菌株均于2019年从成都华西医院患者血液标本分离，并具有相似的耐药谱，应警惕院内感染暴发的可能性。CPEHH菌株C37属于ECCST78型，系统发育分析结果显示ST78型CPEHH菌株具有广泛的时间和空间流行性，从2010年开始在全球7个国家陆续被检测到，是传播碳青霉烯耐药基因的高风险克隆。本研究是对目前CPEHH研究的一个重要补充，应对ST78型CPEHH进行密切监测。
