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1、ChinaAgriculturalUniversity项目编号:创新训练项目立项申请书项目名称BSR-seq方法定位小麦黄化突变基因项目执行时间年项目团队人数人项目负责人姓名学号院系班级手机电子邮箱项目成员1姓名学号院系班级手机电子邮箱项目成员2姓名学号院系班级手机电子邮箱师况导情姓名职务职称iS电子邮箱填表日期年月日项目简介（IOo字以内）小麦产量对于保障世界粮食安全具有重要意义，其生物量的积累及农艺性状备受学者关注。本研究旨在利用以人工合成六倍体小麦SynWt经EMS诱变获得的黄化突变体el37为材料，克隆控制该黄化表型的基因，进一步解析小麦中的叶绿素合成途径，从而辅助在光合层面对提高小麦
2、产量的育种工作。一、申请理由（内容应包括自身具备的知识条件、特长、兴趣和已有的知识基础）二、立项背景（包括国内外研究现状、趋势、研究意义、参考文献和其他有关背景材料）叶色突变体主要有以下两种遗传方式，一种是由核基因控制的遗传，另一种是由细胞质基因控制的遗传。绝大部分的植株叶色突变后的光合作用都会受到一定程度的影响，一般表现为光合效率降低，尤其是黄化叶色突变和白化叶色突变体，其生长还会受到一定的影响，导致不能正常生长发育。叶色突变体在水稻上已有了突破性的进展，相关报道已有很多，大部分的突变体都是由隐性基因所控制。例如Chi等通过研究水稻叶色黄化突变体发现,其受一对隐性基因遗传，该隐性突变基因使水
3、稻在幼苗期就表现出与正常绿色植株明显不同的黄色。1.UO通过对小麦黄化叶色突变体的研究发现该突变体由一对隐性基因控制。目前几乎没有由显性基因控制的突变体的相关报道,这是由于植物维持自身稳定性造成的。突变体大部分会引起叶绿素缺乏降低光合效率，但是也有突变体会提高叶绿素含量的情况，如Gc突变体，该突变体会提高叶片中叶绿素a和b的含量，这在育种中是一种有利突变。王保莉等发现的小麦返白系突变体是一种由于叶绿体基因发生突变而引起的叶色表型发生变化的叶色突变体，这种叶色突变体是由细胞质基因控制遗传的叶色突变体。图位克隆技术是目前应用范围较广的方法，它是一种用于分离编码产物的未知目的基因的技术。图位克隆首次
4、提出在1986由剑桥大学的艾伦库尔森，属于正向遗传学，用该技术克隆基因在进行图位克隆之前无需知道基因的DNA序列,是根据目的基因在染色体上的位置进行的。自从1995年Song等开创基因图位克隆技术，并成功克隆白叶枯基因Xa21基因以来，我们的科学家已经先后克隆了植物中诸多基因。关于小麦叶色突变体的基因定位的研窕，目前相关报道较少，黄绿叶色突变体在其他植物中己经发现，如拟南芥&9、水稻口。R大麦等。WiI等御用图位克隆的技术成功定位出控制叶绿素合成的Ygll基因。MiyOShi等1通过RNAi技术克隆了与水稻叶绿素合成和叶绿体发育有关的基因OSHAP3表达水平的降低会导致叶片呈现淡绿色。BSR-
5、Seq方法是BSA（BulkedSegregantAnaIySiS-集群分离分析法）与RNA-Seq（转录组测序）两种方法的结合，它的基本原理如下:首先选择分离群体中具有极端性状的个体分别构建极端表型高池和极端表型低池两个混样池，然后分别提取混池总RNA进行转录组测序，经过生物信息学分析转录组数据后，用经典贝叶斯算法找到与突变基因共分离的SNP位点，从而预测候选基因【。1.iu等在玉米F2分离群体中各选30株极端表型的植株构建混池，然后进行RNA-Seq,通过数据分析后，把候选基因定位到2Mb的物理区间内，同时利用RNA-Seq差异表达基因分析发现这个区间内有一个编码候选myb转录因子的基因作
6、为候选基因。同样的，利用BSR-Seq和Seq-Walking技术，在玉米汇总得到了g113的候选基因I。BSR-Seq在小麦中也有所应用，主要是旨在开发与目的基因紧密连锁的分子标记。BSR-Seq方法应用在小麦中去精细定位谷蛋白含量基因GPC-B1.并成功的将目的基因定位在遗传距离为0.4cM的区间内网。RamireZ-GonZaleZ等成功地利用BSR-Seq在小麦的FZ群体中挖掘出多个与抗条锈病基因YrlS紧密连锁的分子标记，最终将抗条锈病基因YrIS的遗传区间缩小到0.77CMo除此之外，Wang等网分别利用抗感败血症的鲤鱼构建的混池进行RNA-Seq而后结合BSR-Seq和差异基因表
7、达分析，成功的在鲤鱼中鉴定出17个抗败血症的候选基因。1.iVaja等P”对混池测序的RNA-Seq数据进行从头组装，开发出了BSTA流程，利用此流程在向日葵中分析得到了与目的基因共分离的候选序列。本研究以人工合成六倍体synwt经EMS诱变获得的小麦黄化突变体e137为材料，开展农艺性状观察，光合特性鉴定，遗传学分析和突变基因定位等研究，以期从生理和分子水平上阐明产生黄化突变体的原因，进而在光合层面对提高小麦产量提供分子指导具有重要意义。1TianFX,GongJF,WangGP,etal.ImprovedDroughtResistanceinaWheatStay-GreenMutantTa
8、sglUnderFieldConditions.B101.0GIAP1.ANTARUM,2012,56(3):509515.ChiYH,MoonJC,ParkJH,etal.AbnormalChloroplastDevelopmentandGrowthInhibitioninRiceThioredoxinMKnock-DownPlants.P1.ANTPHYSIO1.OGY,2008,148(2):808-817.3 1.uoP,RenZ.Wheat1.eafChlorosisControlledbyaSingleRecessiveGene.ZhiwuShengIiyuFenziShengwu
9、xueXuebao,2006,32(3):330-338.4 WangQ,SangX,1.ingY,etal.遗传学报,2009,36(11):679684.5王保莉，郭蔼光，汪沛洪.小麦突变体返白系返白阶段叶绿素代谢的变化.ActaBotanicaSinica,1996(07):557-5626 TANKS1.EYSD,GANA1.MW,MARTINGB.Chromosome1.anding-aParadigmforMap-BasedGeneCloninginPlantswith1.argeGenomes.TRENDSINGENETICS,1995.11(2):63-68.7 SongWY,
10、WangG1.,Chen1.1.,etal.AReceptorKinase-1.ikeProteinEncodedbytheRiceDiseaseResistanceGene,Xa21.Science,1995,270(5243):1804-1806.8 1.iuZR,HongSW,EscobarM,etal.ArabidopsisUVH6,aHomologofHumanXPDandYeastRAD3DNARepairGenes,FunctionsinDNARepairandisEssentialforPlantGrowth.P1.ANTPHYSIO1.OGY,2003,132(3):1405
11、-1414.9 JarvisP,DormannP,PetoCA,etal.GalactolipidDeficiencyandAbnormalChloroplastDevelopmentintheArabidopsisMGDSynthase1Mutant.PROCEEDlNGSOFTHENATIONA1.ACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA.2000,97(14):81758179.10 MnS,GiglioneC,1.eeD,etal.RicePeptideDeformylasePDFlBisCrucialforDevelopmentofChl
12、oroplasts.P1.ANTANDCE1.1.PHYSIO1.OGY,2008,49(10):1536-1546.11 JungKH,HurJ,RyuCH,etal.CharacterizationofaRiceChlorophyll-DeficientMutantUsingtheT-DNAGene-TrapSystem.PlantCellPhysiol,2003,44(5):463-472.12 BellemareG,BartlettSG,ChuaNH.BiosynthesisofChlorophyllA/B-BindingPolypeptidesinWildTypeandtheChlo
13、rinaF2MutantofBarley.JBiolChem,1982,257(13):7762-7767.13 PreissS,ThomberJP.StabilityoftheApoproteinsof1.ight-HarvestingComplexIandIIDuringBiogenesisofThylakoidsintheChlorophyllB-1.essBarleyMutantChlorinaF2.PlantPhysiol,1995,107(3):709-717.14 WuZ,ZhangX,HeB,etal.AChlorophyll-DeficientRiceMutantwithIm
14、pairedChlorophyllideEsterificationinChlorophyllBiosynthesis.P1.ANTPHYSIO1.OGY,2007,145(1):29-40.15 MiyoshiK,ItoY,SerizawaA,etal.OsHAP3GenesRegulateChloroplastBiogenesisinRice.PlantJ,2003,36(4):532540.16 1.iuS,YehCT,TangHM,etal.GeneMappingViaBulkedSegregantRNA-Seq(BSR-Seq).P1.oSOne,2012,7(5):e36406.1
15、7 1.i1.,1.iD,1.iuS,etal.TheMaizeGlossy13Gene,ClonedViaBSR-SeqandSeq-walkingEncodesaPutativeABCTransporterRequiredfortheNormalAccumulationofEpicuticularWaxes.P1.oSOne,2013,8(12):e82333.18 TrickM,AdamskiNM,MugfordSG,etal.CombiningSNPDiscoveryFromNext-GenerationSequencingDatawithBulkedSegregantAnalysis
16、(BSA)toFine-MapGenesinPolyploidWheat.BMCP1.ANTBIO1.OGY,2012,12(14):19 Ramirez-GonzalezRH,SegoviaV,BirdN,etal.RNA-SeqBulkedSegregantAnalysisEnablestheIdentificationofHigh-ResolutionGeneticMarkersforBreedinginHexaploidWheat.PlantBiotechnolJ,2015,13(5):613-624.20 WangJ,1.uoM,ChenZ,etal.AegiIopsTauschii
17、SingleNucleotidePolymorphismsShed1.ightOntheOriginsofWheatD-genomeGeneticDiversityandPinpointtheGeographicOriginOfHexaploidWheat.NEWPHYTO1.OGIST,2013,198(3):925-937.21 1.ivajaM,WangY,WieckhorstS,etal.BSTA:ATargetedApproachCombinesBulkedSegregantAnalysiswithNext-GenerationSequencingandDeNovoTranscrip
18、tomeAssemblyforSNPDiscoveryinSunflower.BMCGENOMICS,2013,14(628):三、特色与创新(1)材料特色明显：目前研究中已报道的叶色突变体大部分是从苗期开始就表现出突变的表型，或者是苗期叶色同野生型有差异，但在后期就会慢慢恢复正常叶色表型，本项目所用突变体材料在苗期至拔节期叶色同野生型没有差异，但是在拔节完成后(即营养生长转为生殖生长)，叶色开始出现黄化表型，抽穗期表型最为明显是本项目的特色所在。(2)研究方法上有创新：本研究中用的BSR-Seq的方法，利用混池进行转录组测序的方法，可用于大基因组物种，因为只对mRNA测序，去除了大量的重复序
19、列和无用序列(例如转座子序列等)，减少了测序成本，是一种低价和高效的基因定位方法。同时，数据分析后会将候选基因定位到一个相对较小的物理区间内，较之前的构建所有染色体的连锁图谱确定基因区间减少了很大的工作量。另外因为含有大量的RNA-seq数据，可以看相关基因的表达差异进行基因的功能预测。四、实施计划及方案(包括进度安排、研究方案、实验方案、技术路线等)1、目前已构建黄化突变体el37与叶色正常品种保丰104的Fz分离群体；2、在F2分离群体中进行表型鉴定，取表型极端的植株各30株，取叶片提RNA混池，同时亲本单独提取RNA,进行BSR-Seq,经数据分析预测候选基因所在物理区间。3、两个亲本提
20、取DNA进行重测序，在预测区间筛选在亲本间具有多态性的SSR和INDE1.标记。4、用具有多态性的SSR和INDE1.引物分析分离群体，找出交换单株，计算标记与目的基因的交换值，构建遗传图谱，完成初定位。5、在初定位区间继续开发INDE1.标记，筛选交换单株，进行候选基因精细定位。五、实施基础与条件（包括项目实施应具备的专业知识、基本仪器、设备及实施条件）随着科学技术的不断发展与进步，人们对于基因的认知程度不断加深，克隆基因的相关技术也不断成熟，通过不断实践取得了一系列突破性成果。本研究中黄化小麦是来自人工合成六倍体通过EMS诱变得到的比较新颖的材料，与前人研究材料并不相同；随着测序技术的成熟
21、，BSR-Seq技术近几年在植物基因克隆中应用广泛，而且所用时间短，效果好。（1）本研究中通过EMS诱变获得的黄化突变体材料，黄化表型明显，易于观察。（2）该研究所涉及到的RNA和DNA提取、分子标记分析等技术都是实验室课题组的成熟技术。（3）随着测序技术的不断完善，RNA-Seq结果的可信度高。本实验室已创建完善的测序数据分析流程。（4）本实验室可提供该项研究的一切实验室设备和田间试验条件。实验所需必备设施和条件，主要包括：凝胶成像全自动分析系统、PCR仪、聚丙烯酰胺凝胶（PAGE胶电泳）电泳仪和电泳槽，离心机、灭菌锅、通风橱、智能人工温室等仪器设备。六、预期成果（包括发表论文、竞赛获奖、申请专利及其他）1、精细定位1个与小麦叶片黄化相关的基因；2、发表文章1篇；3、参加竞赛，争取获奖。七、经费预算（包括大概支出科目、金额、计算根据及理由）经费预算总额：元一序号仪器、材料、药品名称单位数量单价总价123456789101112131415合计八、申请人签名项目负责人:项目团队成员:九、导师意见签名：姚颖垠年月日十、学院意见签名学院公章
