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1、一、引言嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞是一种经基因工程化的T细胞，通常表达能识别特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor,CAR),进而激活免疫系统以消灭肿瘤。CAR通常包含三个结构域：识别肿瘤相关抗原的胞外域(如scFv)、信号转导结构域(如CD3)和一个或多个胞内共刺激结构域(如可源自CD284-1BB、0X40等)。CAR-T细胞免疫疗法通常是从采集的患者血液中分离出T细胞，然后在GMP生产车间对其进行基因改造，通过逆转录病毒和慢病毒载体、转座系统(如SB转座系统)或直接将mRNA转导到T细胞内，使T细胞表面表达CAR。在生产车间对这些T细胞进行扩增后
2、将其回输到患者体内，这种经过修饰的T细胞能够特异、高效地识别和杀死肿瘤细胞，从而达到在治疗肿瘤的同时又避免对正常组织的损伤。在靶向CD19分子治疗B细胞恶性肿瘤(急性B淋巴细胞白血病及B细胞淋巴瘤等)的临床试验中，CAR-T细胞显示出令人振奋的疗效及较少的副作用。2017年8月31日，诺华(Novartis)公司宣布，美国食品药品监督管理局(FOodandDrugAdministration,FDA)己批准其开发的靶向CD19的CAR-T产品TiSagenledeUCel(曾用名为CT1.OI9,商品名为Kymriah)上市，用于治疗B细胞前体急性淋巴性白血病(acutelymphoblast
3、icleukemia,A1.1.)o不到两个月后,FDA又批准了第二个CAR-T药物上市,商品名为Yescarta(axicabtageneCiloleucel),是KitePharma公司开发的同样靶向CD19的CAR-T疗法，用于治疗某些类型的大B细胞淋巴瘤的成年患者。针对其他恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗也在不断进展。目前己有500多项关于CAR-T的临床试验正在进行。对于恶性血液病，需要继续开展临床试验，以确定新靶点和新组合。对于实体肿瘤，需要研窕更好的靶点，或优化不完善的靶点，以及克服肿瘤微环境中阻碍T细胞功能的障碍。中国是除了美国之外的第二大进行CAR-T临床研究的国家。截至2018
4、年6月，中国进行的CAR-T临床试验占据了全球的30%左右。从目前临床研究的涉及范围与研究程度来看,CART已经成为了一种不可替代的全新的免疫治疗疗法,未来CAR-T将会成为肿瘤治疗中一块重要的基石。随着越来越多的CAR-T细胞产品申请临床试验和上市，由此带来的这类新产品的质量控制、有效性和安全性研究以及相关管理问题亟待解决。目前国内外关于细胞治疗和基因治疗产品的技术指导原则中对此有一些基本的叙述，但这些指导原则较为宏观，没有具体针对CAR-T细胞产品的技术要求和规范。本文在这些指导原则的基础上，结合CAR-T细胞产品的特点，进一步探讨其质量控制和非临床研究的一般原则，以及其中的几个关键问题。
5、二、CAR-T细胞质量控制和非临床研究的一般原则图1总结了CAR-T细胞质量控制和非临床研究的一般原则。图1CAR-T细胞治疗质量控制与非临床研究一般原则的结构示意图（一）质量控制CAR-T细胞产品目前还没有统一的技术标准，各个制造商在CAR设计、培养技术、基因导入的方法、其他淋巴细胞的去除方法等方面各自不同，对CART细胞的质量控制需结合其具体的生产工艺情况和特点进行考虑。CAR-T细胞的生产过程应按照CGMP的要求进行。CGMP的意图是提供一个框架，以确保在受到良好控制的设施和设备中，由经过良好的定期培训合格的工作人员进行高质量的生产，同时需要一个广泛的系统来记录操作的各个方面以证明持续的
6、合规性。CAR-T细胞产品的质量控制内容，须在参考国内外相关指导原则的基础上，从生物产品、细胞产品和基因治疗产品不同层次综合考虑其特性，进行全面的产品质量、安全性和有效性的检验。CAR-T细胞作为一种活的药物，其制备流程复杂,质量控制环节众多，需要对其进行全过程的质量控制。CAR-T细胞的质量控制包括对生产用材料的检验、生产过程控制的过程检验和成品的放行检验，应分别制定相应的检测指标和可接受的标准范围。另外，还应对CAR-T细胞产品进行生产工艺验证及稳定性研究等。1 .生产用材料的控制CAR-T细胞生产用材料是指用于制备该细胞治疗产品的物质或材料，包括细胞、基因修饰用载体物质、培养基、细胞因子
7、、各种添加成分、冻存液和辅料等。生产用材料直接关系到产品的质量，因此研究者应建立良好、规范的生产用材料的质量管理体系，包括使用风险的评估、生产用材料供应商的审计和质量检测等工作程序。如果由同种异体供者提供T细胞，供者细胞来源应符合国家相关的法律法规和伦理的要求，供者细胞的获取、运输、分选、检验或保存等操作步骤应经过研究和验证，并在此基础上制定明确的规范和要求，比如供者细胞的特征、培养情况、代次、生长特性、保存状态、保存条件以及检验情况等。原则上，对于适合于建立细胞库的供者细胞应建立细胞库进行保存和生产。细胞库的层级可根据细胞自身特性、生产情况和临床应用情况综合考虑；并应建立细胞库的检验标准，检
8、验应满足安全性、质量可控性和（或）有效性的基本要求。自体捐献者不需要资格确认，其病原体筛查和检测是建议性而非强制性的。对于生产过程细胞，如生产病毒载体所用细胞，应符合来源和历史培养情况清晰、安全性风险可控、质量满足生产工艺以及建立细胞库管理等基本原则。目前用于CAR-T细胞生产过程中基因修饰的载体主要是慢病毒载体、逆转录病毒载体和转座子系统，以及采用mRNA电转等方法转染T细胞，使得T细胞表面表达CAR,从而特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并裂解肿瘤细胞。基因修饰用载体从生产流程上看是CAR-T细胞生产过程的原材料，但其本质是作为产品的组成部分进入人体，关于其质量控制的要求，将在后面的3.关
9、键问题中做进一步的叙述。在CAR-T细胞生产过程中使用的培养基、血清、细胞因子、酶、抗体、抗生素和磁珠等每种物质都应予以明确规定，并评估其是否适合预期用途。应通过检验特性、纯度、细菌内毒素、无菌性、外源因子和生物活性，来证明其质量。建议应尽量避免使用含人或动物来源的成分，使用成分尽可能简单的培养基，并避免使用存在致敏可能性的试剂,如B-内酰胺类抗生素。若使用商业来源培养基,应当选择有资质的生产商并由其提供培养基的组成成分资料及相关质量合格证明。除特殊情况外，应当尽可能避免在T细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应当确保其无特定动物源性病毒污染
10、。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。若培养基中含有人的血液成分，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用监管机构己批准的可临床应用的产品。细胞治疗产品中使用的辅料应符合药品辅料相关的要求，宜优选经批准可用于人体的辅料,否则需要开展全面的研究与评估。2 .过程控制和过程检验在CAR-T细胞的生产过程中应进行过程控制和过程检验。过程控制是对生产工艺过程的监控，包括生产工艺参数的监测和过程控制指标的达成等。研窕者应在对整体工艺的理解和对生产产品累积经验的基础上，明确过程控制中关键的生产步骤、制定敏感参数的限定范围，以避免工艺发生偏移。过程检验是对制备
11、过程中的细胞进行质量监控，在关键步骤或中间产品的层面上对产品的关键质量属性进行相应的检验。通过建立这些过程检验的检测方法和验收标准，与细胞放行检验相互结合和互补，以达到对整体工艺和产品质量的控制，保证生产过程的可重复性和最终产品批与批之间的一致性。3 .放行检验在CAR-T细胞产品放行之前，必须进行适当的测试，以确保产品符合明确的放行标准。放行标准的基本原则是提供足够的测试，以确保产品的鉴别、纯度、安全性和效力等符合要求。细胞产品的这些特性通过各种方法进行测试，并通过颁发分析证书来放行产品，分析证书概括了所采用的测试方法和每个测试结果以及其可接受范围。放行检验用方法应经过研究与验证，特别是对于
12、建立的新方法应进行全面的验证，对于药典中收录的方法应进行适用性的验证。当产品的保质期不允许进行完整的质控检测程序用于放行时，可进行简化的放行检测程序。在这种情况下，应明确地描述和说明简化的放行检测程序的理由，同时更关键的是,在放行时缺少的信息需要通过合理的过程检验和更广泛的工艺验证进行适当的弥补。CAR-T细胞的质量控制检测项目应当建立在产品质量研究以及对生产工艺、生产过程和临床适应症充分理解的基础之上，同时兼顾产品的特性和当下的科学认知与共识。随着研究的不断深入（如从临床前阶段进行至临床阶段），工艺相关信息应逐渐获得累积,检验方法应逐步完善，以适应各阶段的质量控制要求,建议确证性临床试验用样
13、品的质量控制与商业化生产时的质量控制要求保持一致。质量控制一般应考虑产品鉴别、生物学效力、纯度、杂质、细胞数量（活细胞数、功能细胞数等）和一般检测（如无菌、支原体、内毒素、外观等）。验收标准的制定应以临床前研究批次、临床研究批次和验证批次中检测获得的数据，以及其他相关数据（如稳定性研究、文献报道和经验等）确定。4 .生产工艺的验证应当在对CAR-T细胞产品制备的全过程进行全面的工艺研究和进行连续多个批次（至少3个批次）生产的工艺验证。在此基础上，制定合适的工艺参数和质量标准，确保对每一过程的有效控制。对于工艺验证时生产的几个批次的产品，与常规生产的产品相比，应对其中间产品和成品进行更为广泛的检
14、测、分析和鉴定，并为确定常规生产产品的过程检验和放行检验的检测指标和质量标准的设置提供部分依据。5 .稳定性研究在CAR-T细胞产品的生产和使用过程中，严格管理的冷链运输以及低温存储对保证细胞产品的质量，防止细菌及支原体污染等情况的发生具有重要作用。对于生产过程中需要临时保存的样品应进行稳定性研究，以支持其保存条件与存放期。CAR-T细胞产品稳定性研究的基本原则可参照一般生物产品稳定性研究的要求，并根据产品自身的特点、临床用药的需求，以及保存、包装和运输的具体情况设计合理的研究方案。例如，对于冷冻储存的细胞产品一般应模拟使用情形（如细胞复苏过程）开展必要的冻融研究。考察项目建议涵盖细胞特性、生
15、物学效力、细胞纯度、活细胞数和比率、功能细胞数及与安全性相关的内容等。（二）非临床研究细胞治疗产品的非临床研究主要包括体外和体内（动物）药效学研究（抗肿瘤活性）、药代动力学研究（CART细胞在体内的增殖、分布和存续时间）及动物体内的安全性研究。CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性与其效力/生物学活性研究密切相关，因此请参考3.3.效力试验相关论述。本部分只讨论涉及动物的非临床研究。1 .G1.P符合性CAR-T细胞治疗产品的药效学和药代动力学研究不需要在药物非临床研窕质量管理规范(goodlaboratorypractice,G1.P)条件下进行。而非临床安全性评价研究应符合G1.P要求，其中对某些
16、可伴随在药效学研究中进行的特殊指标的检测也可以在非G1.P条件下开展，但应保证试验结果的可靠性、完整性，并评估其对产品总体安全性评价的影响。2 .受试物来源用于非临床研究的CAR-T细胞产品一般不必要使用患者的血液进行制备，可以来源于健康志愿者的捐赠。采用动物来源替代产品进行一些概念验证性研究(proof-of-concept)也具有重要的支持作用。3 .受试物分析鉴于CAR-T产品制备过程的特殊性，应提供受试物完整的质量分析报告，并应提供覆盖所有给药浓度以及模拟所有运输过程、处理操作，直至动物给药前过程的受试物稳定性研究数据。如果在给药前需要经过复苏、重悬等处理操作，至少还要在动物给药前对细
17、胞形态、活细胞总数、细胞活率、颜色及除细胞之外的其他外源性异物等进行观察或检测。4 .体内药效学研究目前常用免疫缺陷鼠的移植瘤小鼠模型研究CAR-T细胞对肿瘤的抑制作用。对于治疗淋巴细胞白血病或淋巴瘤的CAR-T细胞,可采用人源细胞,如Raji、DaUdi、NaIm-GUeko-I等细胞株，或者通过基因工程导入特异靶标的特殊稳定细胞株(如CD19-K562CD20-K562等)在免疫缺陷啮齿类动物建立移植淋巴瘤模型。也可采用鼠源细胞(如A20等)建立鼠源模型评价鼠源CAR-T细胞。由于未转染CAR的T细胞也会有非特异性的肿瘤细胞杀伤作用，除了溶媒对照外，最好设置T细胞对照组(未转导CAR的T细
18、胞、模拟转导的T细胞或者半抗原特异性CAR-T细胞)。CAR-T细胞药效研究的最直观的方法通常采用生物发光成像(bioluminescentimaging,B1.l)技术，检测表达荧光素酶的肿瘤细胞。其他检测方法包括：流式细胞术检测动物体内肿瘤细胞的数量；流式细胞术、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassaysyE1.ISA)MSD(mesoscalediscovery)等免疫学方法检测血清中与肿瘤相关的细胞因子的变化，间接反映药效学结果。5 .药代动力学研窕在非临床研究中，还应该阐明细胞的体内过程，这对研究细胞的活性和安全性至关重要。由于免疫排斥问题，人
19、源CAR-T细胞通常采用免疫缺陷动物进行研究。一般情况下，CAR-T细胞进入体内后在肿瘤细胞的存在下会大量增殖并发挥生物学作用，因此，目前CAR-T细胞最常用的药代检测模型多为移植瘤模型。非荷瘤模型的分布研究可以进行分布差异的对比。CAR-T细胞的药代研究主要关注目标细胞在体内增殖、分布和存续时间，可选择的技术方法有成像技术、流式细胞术、免疫组化技术、定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术等，不同的方法适用于不同的检测样本和检测目的。成像法可以直观检测CAR-T细胞的体内分布，需要对细胞进行各种标记，如放射性同位素标记、遗传修饰（如表达绿色荧光蛋白、荧光
20、素酶）标记、纳米粒子标记（如铁-葡聚糖纳米粒子）等；流式细胞术可以检测动物血液、骨髓和脾脏中的CAR-T细胞；免疫组化的方法可以检测脾脏或其他脏器中CD3+细胞或CAR+细胞的分布，以指示人T细胞在脏器中的分布和累积；定量PCR方法可以检测所有类型样本中代表人源CAR-T细胞的DNA或者RNA水平。目前:一些新的技术（如原位杂交等方法）也被开发用来检测CAR-T细胞的组织分布。6 .非临床安全性研究根据已经进行的CAR-T细胞的临床研究结果，该类产品的安全性风险主要包括：细胞因子释放综合征、神经毒性、B细胞减少等。另外，转基因细胞的成瘤性/致瘤性问题也需要重点考虑。上述不良反应需要在非临床动物
21、研究中进行何种程度的预测国内外尚无统一标准。同时动物毒理学研究也存在着动物模型、种属特异性等具有挑战性的难题。动物安全性研究除了常规毒理学指标（临床症状、体重、摄食量、血清生化、血液学、大体病理和组织病理学）外，还包括免疫毒性指标，如移植物抗宿主反应（graft-versus-hostreaction,GVHR）、外周血细胞计数及表型分析、血清细胞因子水平（如I1.-2、I1.-6、INF,、TNF-等）等的检测。另外，如果可能，也可以结合或者单独进行安全药理学、局部耐受性等研窕。一般不进行常规遗传毒性组合研究和生殖毒性的研究。致瘤性研究也需要进行特殊考虑。三、关键问题图2总结了Car-T细胞
22、质量控制和非临床研究的关键问题。KeyissuesOtherissuesAnimalselectionNeurotoxicityTumorigenicityImprovementofthepredictability图2CAR-T细胞治疗质量控制与非临床研究关键问题的结构示意图（一）基因修饰用载体的质量控制CAR-T细胞产品是基因治疗与细胞治疗技术结合的产物。载体作为基因治疗的工具，可能带来插入突变、复制型病毒、外源因子污染等风险，同时其携带的遗传物质是CAR-T细胞的重要组成部分，是使T细胞具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞活性的重要基础。因此，载体的质量至关重要，与生产中所用的其他原材料特性完全
23、不同，应作为产品的组成部分进行管理。基因修饰用载体的生产和质量控制应符合已颁布的基因治疗产品相关指导原则的要求。同时，由于对基因治疗产品多年的研究，其质量控制在中国和国外己有许多的经验和文献可供参考。基因修饰用载体应是在CGMP条件下生产的,具有高品质并已经过全面质量检测的临床级产品。载体的生产工艺须经过验证，证明它可以用控制的工艺流程重复生产出安全有效的、质量一致的载体。载体生产通常需要的关键原材料是细胞、培养基和血清以及质粒。其中每一项都必须来自经批准的供应商，并且应该经过严格的测试程序，以降低将外源因子引入生产过程的风险。包装逆转录病毒的稳转细胞需要建立细胞库体系，而瞬时转染的慢病毒载体
24、制备系统需要建立菌种库及细胞库体系，各自需要按照相应要求进行管理和检测。建立的细胞库、毒种库和菌种库以及源自动物的培养基成分同样需要进行广泛的检测。生产过程中收获的载体应进行纯化，并在适宜的制剂配方下保存，同时应开展稳定性研究保证载体产品的稳定性。对于逆转录病毒载体、慢病毒载体以及转座子质粒系统，载体终产品的质量控制通常的检测项目见表I0应根据不同载体的本身特点及生产工艺情况，建立其质量控制项目和标准。另外，由于CAR-T细胞的基因修饰用载体不是直接进入患者体内，而是随细胞的工艺过程经过稀释和洗涤等步骤，因此需要按照工艺验证和风险评估的情况制定合理的质量标准。表1CAR-T细胞基因修饰用载体的
25、常规质控项目CategoryAxsayvofrctrovinlntivi11dVeCtonIdeolrtyRT-PCRXquCnCingPotencyconcentrationPuntyInfcctiouKtninxducingtiterPafliClCnumber(P24EI.ISAParticktoEfocliousYranMiucinftitermioTnuisgcneCprCAilmBigetMMHinCtiOaIlityHostcellPrtMemHoaccllDNAResidualrvagcnt(anibioBSA.BenxonM.etc.)juayoftnmspOMinplasm
26、idvector%RcUnclionenzyme11upp.functionalityPtiysiochcfmcalcharacteristicsStcnlityBxicruilcn4ooinRClVRC1.AdventitiousvirusMyCoPUKmaAppearancePHOMnolaIIlyPartklcsizednlnbulionAJA.HP1.Cpurity(includingrat100fWpcrcoilcdDNA)HottceilproteinIIoaccIIDNABBCteriaIRNAAntibiotic%SlcnlityBctcrialcndoNalm-6Jeko-I
27、等细胞株，或者通过基因工程导入特异靶标的特殊稳定细胞株（如CD19-K562,CD20-K562等）在免疫缺陷啮齿类动物建立移植淋巴瘤模型。也可采用鼠源细胞如A20等建立鼠源模型评价鼠源CAR-T细胞。目前用于CAR-T细胞非临床安全性研究的动物模型各有优缺点。同源小鼠模型和表达人肿瘤相关抗原（TAA）的转基因小鼠具有完整的免疫系统，但是，其局限性在于受试的CAR-T细胞需要的是鼠来源的细胞。移植瘤小鼠模型作为疾病动物模型可以模拟CAR-T的作用过程，其缺点是没有宿主免疫系统，不能完全模拟人体中出现的CRS带来的级联反应，不能检测脱靶毒性。非荷瘤的免疫缺陷鼠由于缺乏免疫细胞，不会产生免疫排斥反
28、应，可以使CAR-T细胞在其体内较长时间存活，更适合对CAR-T细胞制剂的整体安全性风险以及成瘤性/致瘤性进行研究。免疫系统重建小鼠模型可以在动物体内模拟人免疫系统，但是，这种模型的统一和标准化目前尚存在难点，比如，用于制备模型的人CD34+造血干细胞/祖细胞（hematopoieticstem/PrOgenitOrCells,HSPC）的来源多种多样、重建鼠个体差异大、重建的免疫系统与CAR-T细胞会发生免疫排斥、髓系细胞发育不全等。非人灵长类（猴）免疫系统和生理学与人接近，对于预测CAR-T细胞在人体的安全性本该是较为适宜的动物模型。但是，因为免疫原性的问题，在猴体内不能对CAR-T进行长
29、期毒性的研究，目前在CAR-T研究中应用的报道很少。（七）神经毒性的考察目前，还没有很好的动物模型和方法可以在临床前很好地预测临床上出现的CAR-T细胞的神经毒性。常规的安全药理学功能观察试验组合（functionalobservationbattery,FOB）研究等不一定适合CAR-T细胞的作用特点，有研窕认为，CAR-T细胞治疗产生的神经毒性可能与细胞因子水平升高有关。因此，可以尽可能地考虑神经毒性研究与其他毒性研究的结合，重点是在临床研究中出现CRS的时间点观察神经毒性。对于在不能很好地模拟CRS的动物模型中进行的神经毒性考察的意义需要审慎考虑。（八）致瘤性研究作为一种终末分化的体细胞
30、治疗产品，理论上CAR-T细胞成瘤性/致瘤性风险较低。体外评价方法软琼脂克隆试验可通常表现为阴性结果。在基因组插入位点分析中，因插入是随机的，每例患者的插入位点可能不尽相同；即使插入位点为可能致瘤的位点，随着CAR-T细胞死亡或体内对CAR-T细胞的免疫应答，也无法确定其致瘤性。但对于导入了外源基因的CAR-T细胞产品，需通过病毒载体插入人基因组的插入位点分析、体外细胞永生化增殖、体内研究中异常/异位增生性病变（如增生、肿瘤）等研究初步评估其致瘤性风险。体内致瘤性研究可与较长周期的动物毒理学究伴随开展，可以在临床试验期间完成。（九）提高非临床研究的预测性目前CART非临床动物研究亟需解决的问题
31、是对临床研究安全性风险预测的相关性问题。如果没有特别合适的动物模型模拟人源细胞在机体内最主要的生物学活性反应过程，动物研究对临床风险的外推意义就会大打折扣。鉴于CAR-T细胞是个性化程度很高的治疗产品，并且有很多的临床研究经验，动物实验研究应该侧重于生物分布以及机理/活性验证研究，比如，采用同源细胞产品在动物源性疾病模型进行药效和毒性研究，或者与常规肿瘤药效学相同，采用免疫缺陷动物移植人肿瘤模型进行人源CAR-T细胞的研究。最终的安全性和有效性评价应该以临床试验作为最重要的证据支持。四、结论CAR-T细胞产品是一种新型的复杂的生物产品，其不断开发将会带来越来越多的产品进入临床试验和上市使用，这些产品的质量控制和非临床研窕对于保障这些产品安全、有效具有重要意义，同时也具有较大的挑战和困难。本文针对CAR-T的具体特点，结合细胞治疗和基因治疗的相关技术指南提出其中的一般原则和关键问题，希望能为相关产品的研发和生产人员有益参考。
