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1、ICS65.020.20CCSB16OB中华人民共和家标准修订GB/T281082011顶羽菊检测鉴定方法DetectionandidentificationofRhaponticumrepens(1.)Hidalgo(征求意见稿)-义发布-X实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会U-A刖S本文件按照GB1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件代替GBZT281082011匍匐矢车菊检疫鉴定方法。与GB“281082011相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：修改了物种
2、中文名和学名，根据国际植物分类学法规，将文件中匍匐矢车菊变更为顶羽菊，将Centaurearepens1.更正为Rhaponticumrepens（1.）Hidalgo；增加了“规范性引用文件”（见2）；修改了“术语和定义”（见2011年版的2）,并增加了“缩略语”（见3）；修改了“匍匐矢车菊基本信息（见2011年版的3）,变更为“顶羽菊分类信息”（见4）；修改了“方法原理”（见2011年版的4）；修改了“仪器和用具“（见2011年版的5）,变更为“器具和试剂“（见6）；删除了“实验室检测鉴定（见2011年版的6）；增加了“检测与取样”（见7）；增加了“样品制备”（见8）；修改了“鉴定方法”（
3、见2011年版的6.3）；修改了“匍匐矢车菊的形态特征”（见2011年版的7）；增加了“分子生物学鉴定”（见9.2）；修改了“结果评定”（见2011年版的8）,变更为“结果判定”（见10）；修改了“标本和样品保存与处理”（见2011年版的8）,变更为“样本保存和处理”（见11）；增加了顶羽菊近似种的植株图片（见附录B）；增加了顶羽菊模式标本图片（见附录C）；增加了顶羽菊ITS序列扩增及测序信息（见附录D）。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、宁夏农技推广总站、中华人民共和国福州海关技术中心等本文件主要起草人：本文件代替了GB/
4、T28108201U顶羽菊检测鉴定方法4范围本文件描述了顶羽菊的形态学和分子生物学检测鉴定方法。本文件适用于顶羽菊的检测鉴定。5规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。6术语、定义和缩略语6.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。总苞involucre：生于花序下或花序每一分枝下或花梗基部下的变态叶称为苞片，当多枚苞叶成轮状紧密包围花序时称总苞。单性花unisexualflower：一朵花中只有雄蕊或雌蕊的花。管状花：花冠连合成管状，缘部5裂，少4裂。连萼瘦果cypselae：干的单种子果实。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)
5、ITS：核糖体DNA内转录间隔区1和内转录间隔区2,以及5.8S核糖体基因(internaltranscribedspacers1and2andtheintervening5.8Sribosomalgene)PCR：聚合酶链式反应(POIymeraSeChainreaCtion)实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应(Real-TimePolymeraseChainReaction)EmDEA：酶介导双重指数扩增(EnZymeS-mediatedDuplexExponentialAmplification)7顶羽菊分类信息学名：Rhaponticumrepens(1.)Hidalgo异名：Ac
6、roptilonrepens(1.)DC.,Centaurearepens1.中文名：顶羽菊(匍匐矢车菊)分类地位：菊科(Compositae),漏芦属(RhaPOmieUln)。其它基本信息见附录A。8方法原理植株、花序、花、瘦果等形态特征是鉴定该属种类的主要依据；ITS序列、实时荧光PCR、EmDEA是基于形态学准确鉴定的凭证标本和样品基础上，开发的分子生物学检测方法。当植物体组织完好，且具备花、果等繁殖器官，可仅采用形态学鉴定。当送检样品是植株幼苗、叶片、不完整的花或果实等植物组织时，需采用形态学和分子生物学相结合的方法。6器具和试剂6.1 仪器体视显微镜、电子天平（感量0.001kg,
7、0.0Olg）、液氮罐、纯水机、水浴锅、高压灭菌器、高温干燥箱、离心机、电泳仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、核酸浓度检测仪、荧光恒温检测仪等。6.2 用具解剖针、放大镜、直尺、镶子、培养皿、样品袋、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、可调移液器（Io（X）1.,2001.,1001.,201.,101.,2.5心、可调移液器枪头等。6.3 试剂干燥剂、防虫剂、植物基因组提取试剂盒，PCRs实时荧光PCR、EmDEA反应体系常用试剂等。7检测与取样7.1 监测现场在检疫现场采集植株鉴定用样品，要求植株完整，形态学特征完好。花部鉴定用样品，要求处于果实成熟期、外型完整。种子鉴定用样品，要求发育成熟、籽粒
8、饱满、外型完好。7.2 植物产品将现场检疫抽取的送检样品充分混匀，制成平均样品。采用四分法，视样品多少取平均样品的二分之一至四分之三（较少样品时）作为试验样品，称取其重量并记录，每份试验样品不少于1kg,剩余的平均样品加贴标签作为保留样品保存。送检样品不足1kg的全部检测。8样品制备8.1 形态学8.1.1 植株在解剖镜或放大镜下镜检。进行植株花部特征和胞果内部特征观察时，辅以解剖刀、解剖针等工具。8.1.2 瘦果混杂于植物原粮和种子中的菊科胞果或种子，一般在孔径为10mm筛下物中获得。当样品量少时，也可将全部样品放入白瓷盘中进行人工挑检。8.2 分子生物学将待测疑似顶羽菊植物的半粒瘦果、微量
9、干燥或新鲜叶片、微量种子或植物组织粉末置于1.5ml或2ml离心管中，加入至少451.裂解液，室温静置2min以上，或95加热2min至10min。后取上清液4或-20C保存备用。使用常见商品化试剂盒提取植物基因组DNAo用以提取核酸的植物组织用量参照所采用商品化试剂盒使用说明。9鉴定方法9.1 形态特征1 .1.1漏芦属多年生草本。茎直立，单生，不分枝或分枝，或无茎。头状花序同型，大，单生茎端或茎枝顶端。总苞半球形。总苞片多层多数，向内层渐长，卷瓦状排列，顶端有膜质附属物。花托稍突起，被稠密的托毛。全部小花两性，管状，花冠紫红色，很少为黄色，细管部几等长或细管部较长，花冠5裂，裂片线形。花药
10、基部附属物箭形，彼此结合包围花丝。花丝粗厚，被稠密的乳突。花柱超出花冠，上部增粗，中部有毛环。瘦果长椭圆形，压扁，4棱，棱间有细脉纹，顶端有果缘，侧生着生面。冠毛2至多层，外层较短，向内层渐长，褐色，基部连合成环，整体脱落；冠毛刚毛糙毛状或短羽毛状。全属约24种。属内部分种类形态特征比较参见附录B。9 .1.2顶羽菊9.1.1.1 植株和茎多年生草本，高2570cm。根直伸。9. 1.2.2叶全部茎叶质地稍坚硬，长椭圆形或匙形或线形，长2.55cm,宽0.61.2cm,顶端钝或圆形或急尖而有小尖头，边缘全缘，无锯齿或少数不明显的细尖齿，或叶羽状半裂，侧裂片三角形或斜三角形，两面灰绿色，被稀疏蛛
11、丝毛或脱毛。10. 1.2.3花序植株含多数头状花序，头状花序多数在茎枝顶端排成伞房花序或伞房圆锥花序。11. 1.2.4总苞总苞卵形或椭圆状卵形，直径051.5cm。总苞片约8层，覆瓦状排列，向内层渐长，外层与中层卵形或宽倒卵形，包括附属物长3-11mm,宽26mm,上部有附属物，附属物圆钝；内层披针形或线状披针形，包括附属物长约1.3cm,宽23mm,顶端附属物小。全部苞片附属物白色，透明，两面被稠密的长直毛。全部小花两性，管状，花冠粉红色或淡紫色，长1.4cm,细管部长7mm,檐部长7mm,花冠裂片长3mmo12. 1.2.5瘦果瘦果倒长卵形，长354mm,宽约2.5mm,淡白色，顶端圆
12、形，无果缘，基底着生面稍见偏斜。冠毛白色，多层，向内层渐长，长达1.2cm,全部冠毛刚毛基部不连合成环，不脱落或分散脱落，短羽毛状。13. 分子生物学鉴定9. 2.1ITS序列扩增及测序ITS序列扩增及测序的信息见附录Eo10. 2.2实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测具体步骤见附录Fo11. 2.3EmDEA检测EmDEA检测具体步骤见附录Go11.1 植株鉴定植物体各部分组织完整，参照9.1及附录B、附录C和附录D所述顶羽菊属植株形态特征，可判定为顶羽菊。11.2 种子及部分组织鉴定参照9.1及附录B、附录C和附录D所述瘦果或叶片等部分组织形态特征，并与附录E所列ITS参考序列一致性在9
13、9.70%以上时，可判定为顶羽菊。12. 3实时荧光PCR检测结果使用相应的引物和探针进行实时荧光PCR检测，根据仪器操作规定设置基线和阈值线,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：检测样品出现典型扩增曲线，Ct值小于或等于30,判定顶羽菊阳性；检测样品出现典型扩增曲线，Ct值大于或等于35,判定顶羽菊阴性；Ct值在3035之间，增加DNA用量25倍再次测试，出现典型扩增曲线，如Ct值小于或等于30,判定顶羽菊阳性，否则阴性。10.4EmDEA检测结果使用相应的引物和探针进行EmDEA检测，根据仪器操作规定设置基线和阈值线，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：Ct值或
14、Tt值小于或等于20,判定顶羽菊阳性；Ct值或Tt值大于20或无数值，判定顶羽菊阴性。11样本保存和处理标本的保存方法应符合GB/T27402-2008中4.5标本的要求。无害化处理应符合GB19489-2008中7.19废物处置。附录A（资料性）顶羽菊其它基本信息A.I地理分布我国山西、河北、内蒙古、陕西、青海、甘肃、新疆、宁夏有分部。俄罗斯中亚和西伯利亚、蒙古、伊朗也有分布.A.2生物学特性及危害多年生草本，生于山坡、丘陵、平原，农田、荒地。具发达的弱匐根系，主根深入土壤长达10米。被除去繁殖枝的残留根茎可分票快速生长、扩散，分蕤新生成的植株基生叶莲座状，与繁殖枝明显不同。此外，根系分泌的
15、化感物质也严重影响作物生长，导致土壤肥力下降，属极为恶性杂草。收录于中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录（第416种）。A3传播途径瘦果常混杂于作物种子中，随调运传播扩散。曾在进口美国、墨西哥、巴西小麦，美国进口大豆中发现。附录B（资料性）顶羽菊及同属种形态特征图顶羽菊及同属种植株形态特征见图B.lo（八）Rhaponticuinuniflorum(c)RhaponticumSCariOSlUn(b)RhaponticumCarthamoides(e)Rhaponticuinrepens附录C（资料性）顶羽菊形态特征C.1顶羽菊植株顶羽菊植株形态特征见图CJo图C.1顶羽菊植株C.2顶羽菊
16、模式标本顶羽菊模式标本（Nunallsn）由NUItall采集于美国密苏里河岸边的曼丹堡，见图C.2。C.3顶羽菊瘦果顶羽菊瘦果形态特征见图CJo图C.3顶羽菊瘦果附录D（资料性）ITS序列扩增及测序信息D.1引物序列ITS4:5,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3its5：5,-ccccGcttattgatatgc-3,注：该引物为通用引物，每次扩增必须做空白对照，以确认是否污染。D.2扩增体系及程序25l或50l体系，采用商品化的PCR试剂盒进行扩增。反应体系中引物初始浓度为10M,模板DNA含量约20ng或以所采用的商品化PCR试剂盒说明书为准。扩增程序中，ITS序列退火温度推
17、荐为5255C。其余参数参照所采用商品化PCR试剂盒说明书。D.3电泳及测序ITS序列扩增产物电泳条件：5lPCR产物，1.0%琼脂糖，1XTAE缓冲液。以DNA分子量标记作为对照，ITS序列扩增产物约700bpoITS序列测序引物为ITS4及ITS5。D.4ITS参考序列ITS序列扩增产物电泳条件：5lPCR产物，1.0%琼脂糖，IxTAE缓冲液。以DNA分子量标记作为对照，FTS序列扩增产物约700bpoITS序列测序引物为ITS4及ITS5。以下给出了顶羽菊ITS参考序列号。EU409919.1HM009320.1AY826223.1JN639860.1JN202400.1JX27451
18、8.1附录E（资料性）实时荧光PCR检测FJ引物及探针序列特异性引物F：-3mR：5探针：5-（FAM）-3F.2反应体系及反应程序20l体系，其中2x荧光PCR反应预混液（T5FastQpcrMix（Probe）10l,正反向引物（10mol1.）各0.41.,TaqMan探针（10mol1.）0.21.,50xROXReferenceDyeII0.41.,DNA模板l1.,超纯水7.61.）实时荧光PCR反应程序为第一个循环955min；随后40个循环，9510s,60Imino注：不同仪器根据仪器要求将反应参数作适当调整。附录F（资料性）EmDEA检测G.1引物及探针序列DNA上游引物F：5-G.2反应体系及扩增程序反应体系：共20l其中20MDNA上、下游引物各0.5l,25Ong1.RNA引物0.3l,1.7l无核酸防水MiX预混液3l,20MDNA模板5l,余量为激活液。扩增程序：42C30个循环，恒温扩增25-30mino注：不同仪器根据仪器要求将反应参数作适当调整。参考文献
