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1、关于靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用【摘要】目的研究以宿主基因ASGPR为靶的反义核酸的抗-HBV作用，为HBV感染的用药提供新的思路。方法以HePG212115细胞为靶细胞，脂质体为载体将靶向ASGPR的硫代反义寡核昔酸(ASODN)转染至HePG212115细胞中，72h后收集细胞培养液，采用酶联免疫法及荧光定量PCR法测定细胞培养液中HBSAg、HBeAg0结果结果表明，随着浓度的升高，ASODN抗HBsAg,HBeAg和HBVDNA的作用逐渐增强。当ASODN高于0.5HmOl/1.时作用逐渐减弱。结论ASODN具有抗HBSAg,HBeAg和HBVDNA的作用。【关键词】寡核甘
2、酸反义乙型肝炎病毒【Abstract】ObjeCtiVeToinVeStigatetheinhibitoryeffectsagainstHBVofaphosphorothioateantisenseoligodeoxynucleotidezzASODNwtargetedtoASGPRinvitro.TheassayattemptedtoaccessanewmethodandideatorefreshthethinkingwayabouthepatitisBtreatmentbytheASODNtargetedtoasialoglycoproteinreceptor(ASGPR).Methods
3、(ASGPR)mRNAwassynthesizedUsingHepG212115cellasthetargetCel1.ASODNwastransfectedintoHepG212115cellbyIipofection.Thecultureswereincubatedfor72h.Thencellmediawerecollectedanddetected.HBVDNAlevelincellmediumwasexaminedbyreal-timePCR.HBsAgandHBeAgweredetectedbyE1.ISAl.ResultsOurResultsshowedthatASODNshow
4、edanadditiveeffecttowardstheinhibitionofHBsAg,HBeAgandHBVDNAWiththeincreasingofASODNconcentration.TheeffectdecreasedgraduallywhenthelevelofASODNconcentrationhigherthan0.5mol1.ConclusionItisconcludedthatundercertainexperimentalconditions,theASODNisapowerfulanti-HbsAg,anti-HbeAgandHBVDNA.Keywordsantis
5、enseoligodeoxynucleotideshepatitisBvirus乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高1。乙型病毒性肝炎以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。少数患者可转化为肝硬化或肝癌。，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病。血清中HBSAg阳性是HBV感染的标志B，4。本身具有抗原性，无传染性。HBeAg为HBV复制的重要指标5,6。在于乙肝表面抗原阳性血液中。HBV-DNA阳性是表示HBV复制的最可靠指标7o近年用多聚酶链反应（PCR）这一体外DNA扩增技术，可测出极
6、微量的病毒.反义寡核昔酸（antisenseoligonucleotide）通常指进行了某些化学修饰的短链核酸（约15-25个核甘酸组成），它的碱基顺序排列与特定的靶标RNA序列互补，与靶标基因的RNA结合后可通过各种不同的机制影响靶标基因的表达8。反义寡核甘酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重要工具。大多数药物属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，因此反义寡核甘酸模拟了药物的作用,在靶标实验中证明有效的反义寡核甘酸本身还可以被进一步开发成为反义寡核昔酸药物9,10。去唾液酸糖蛋白受体(ASialOglyCOPrOteinReCePtOrASGPR)是肝细胞的一种重要且高效的内吞受体，主
7、要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜上，又名肝凝集素(IiVelectin).,ASGPR的主要生理功能是负责清除去唾液酸糖蛋白、凋亡细胞和脂蛋白等。在肝脏基因定向转移、靶向药物治疗当中具有较高的应用价值11。以往研究表明，根据去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR)基因mRNA的二级结构设计并筛选出的反义寡核甘酸(anti2senseoligodeoxynucleotide,ASODN),能有效地抑制HepG212115细胞分泌的HBSAg、HBeAgHBV-DNA12.,本实验以HePG212115细胞为模型，观察ASODN的抗-HBV作用。
8、1材料与方法1.1细胞培养HepG212115细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清(FBS,Gibco),380gmlG418(Promega)的MEM细胞培养液置37团，5%(体积分数)(：02孵箱培养。1.2试剂1.ipofectin购自美国InVitrOgen公司，乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司，乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司。1.3寡核甘酸的制备ASODN(5z2CCTCCCAGGACGT2GACCACC23,)由ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，用MiCrOPUre团反向纯化柱(OligOPrePOP120,SAVAN
9、T)纯化。1.4HepG212115细胞给药在96孔板中，每孔加入含6x103个HePG212115细胞的100l的细胞培养液，置370,5%CO2孵箱培养72h0用1.ipofectin按照其说明书进行A2S0DN转染。ASODN终浓度为OllHmOI/1.、012mol/1.014mol1.o分别取ASODN的3个浓度(OllHmoI/1.、012Umol/1.、014mol/1.）,每个重复3个孔。以不给药组作为空白对照组。继续培养72h后收集培养液，-20团保存备用。1.5寡合甘酸药对HePG212115细胞分泌HBSAg、HBeAg的抑制作用检测将收集好的培养液按照乙型肝炎病毒表面抗
10、原诊断试剂盒（华美生物工程公司），乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒（华美生物工程公司）说明书操作。各取50l培养Q液加入表面抗原及e抗原包被的96孔板中，再加入50M相应的酶标结合物，37团孵育lh。相应洗液洗板5次，再依次加入50d显色液A及50B显色液B,37回避光显色15min,最后加入50l终止液。在多标记酶联免疫检测仪（VIC2T0RTMWallac1420MultilabelCounter,Wallac）上测定450nm处Is吸光值Ao根据IR=（A450对照-A450给药）/A450对照计算抑制率。1.6对HepG212115细胞分泌HBVDNA的抑制作用检测将收集好的培养液，100
11、国煮沸15min,12000rmin离心IOmin,取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法13操作。定量检测HBVDNA的引物序列为，PI52GgagtatggattcgCAeTCCTC23：P2：5,2TtgttgttgtaggggacctgccT3zo荧光探针序列F:52ACTrCCGGAAACTACTGTTAGACGA23，;淬灭探针序列Q:52GTAGECCGGAAGT3120l反应体系含20OnmOI/1.引物,670nmol/1.荧光探针F,180nmol/1.淬灭探针Q,200mol/1.dNTP,410mmol/1.的Mg2+
12、,2l模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCyde自动PCR仪中进行扩增,扩增条件为:94团30s,55030s,72E30s,共40个循环，反应后由电脑自动计算出定量结果。2结果2.1寡核甘酸药对HePG212115细胞分泌HBSAg、HBeAg的抑制2.1.1.寡核甘酸药对HePG212115细胞分泌HBSAg的抑制。从表1中可以看出，随着ASODN浓度的增加，对HBSAg的抑制率增强。ASODN取0.5mol/1.时对HBsAg的抑制率达到最高峰，取0.6mol/1.和0.7HmOI/1.时对HBsAg的抑制率逐渐下降。2.1.2寡核昔酸药对HePG212115细胞分泌HBe
13、Ag的抑制随着ASODN浓度的增加,对HBeAg的抑制率增强。ASoDN取0.4mol/1.时对HBeAg的抑制率达到最高峰，为31.1%,后随着浓度的升高，对HBeAg的抑制率逐渐下降（表Do2.1.3寡核甘酸药对HepG212115细胞分泌HBVDNA的抑制ASODN取0.5mol/1.时对HBVDNA的抑制率达到60%,为最高峰，后随着浓度的升高，对HBVDNA的抑制率逐渐下降（表Do表1ASODN对HBsAg,HBeAg和HBVDNA的抑制作用TableITheinhibitiveeffectofASODNagainstHBsAg,HBeAgandHBVDNA3讨论抗病毒是乙肝治疗的关
14、键，口服抗病毒药物以拉米夫定为代表，在中国上市10年，积累了丰富的经验。临床应用的免疫调节可以提高抗病毒免疫14。目前抗病毒药物，效果都不十分满意15。应用后可暂时抑制HBV复制，停药后这种抑制作用消失，使原被抑制的指标又回复到原水平。有些药物作用较慢，需较长时间才能看到效果。HBV基因组虽为双链环形DNA,但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。乙型肝炎抗病毒治疗，其关键在于药物能否抑制HBV的超螺旋共价闭合环形DNA(cccDNA),而现有抗病毒药对肝细胞核中病毒cccDNA无作用。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR)是数量丰富的一种主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面的内吞受体，有研究表明，ASGPR可以与HBV病毒颗粒特异性结合并介导它们进入肝脏细胞，从而使乙肝病毒感染肝细胞160本室的研究也表明ASGPR在HePG2细胞中低表达，而在HepG212115细胞中高表达1刀。而靶向ASG2PR的ASODN能选择性的抑制ASGPR的活性，从而有效地抑制HepG212115细胞分泌的HBsAgHBeAg.HBV2DNA13o反义核糖核酸可封闭病毒复制的关键编码基因，这种基因水平的靶向治疗可能给乙肝治疗带来新的希望。
