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1、ICSI1.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T2302024RVK/T230-2002实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南Guidelinesforimplementationofreal-timefluorescentpolymerasechainreactioninclinicalIabomtories.2024-05-09发布2024-11-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布目次Wn1I莅国I2规莅性引用文件I3术语和定义J4缩略谓35样木采柒和处理36方:2.77污染预防和控制88质址管理IO9结果判读和报告1510实验室生物安全16Il临床适用范困1
2、6附录A（资料性附录）常用实时荧光PCR技术方法17时双B（资料性附录）实时英光PCR技术临床适用他国18参考文献21本标准为推荐性标准。本标准代替WS/T230-2002临床诊断中聚合由燧反应（PCR）技术的应用,与US/T230-2002相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如一更改了“范Ifr部分（见第1章，2002年版的笫1章），较WS/T2302002将所述技术范明由“PCR”缩小为“实时英光PCR”;一一增加了“规范性引用文件”部分（见第2章）：一一更改了“术谱和定义”部分（见第3章,2002年版的第2聿）；一一地加了“缩略语”部分（见第4章）；一一将“标本的收集、运输、处理
3、和存放”部分更身为“样本采集和处理”，对2002年版相关内容进行细化补充后纳入（见第5题,2002年版的第5章）；在“方法”中增加了针对实时戋光PCR技术的扩增体系、扩增反应内容，删除了该技术以外的其他PCR产物分析方法（见第6帝，2002年版的第I章）：一一在“污染预防和控制中增加了污染的处理与控制要求内容（见第7章，2002年版的第6段）：一将“质量控制”部分更改为“质量管理”，增加了人员及实脸室、设箸管理要求、方法性能命证、室内质控、实验室同比对要求内容（见第8章，2002年版的第7章）；-ft结果的判读、报告和解群”部分更改为“结果判读和报告”.增加检测方法局限性、结果报告要素、检测结
4、果解择内容（见第9章，2002年版的第8曲）：一一增加了“实验室生物安全”部分（见第10章）：一一将“用途”部分更近为“临床适用他国”，删除了过箱实验、诊断实验、蛤证实聆内容（见笫11章，2002年版的第3章）；一删除/2002年版“附录”内容（见2002年版的附录A“定IRPCR技术、附录B“对生产厂商的要求和建议”）：一一增加了资料性附录A常用实时荧光PCR技术方法”（见附录笛：一一增加了资料性附录B实时荧光PcR技术临床适用范围”（见附录B）.本标准由国家卫生健康标准委员会峪床检蛤标准专业委员会负责技术申宣和技术杏询，由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负由协询性和格式申杏，由国家TJ生
5、健康委M会医政司负击业务管理、法规司负货统筹管理.本标准主要起草单位：发旦大学附属中山医院、昆明医科大学第一附属医院、中国科学技术大学附M第一医院、发旦大学附属华山医院、北京大学人民医院、浙江省人民医院、中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心.本标准主要起草人:潘柏叭郭玮、段勇、沈佐君、关明、赵晓涛、荣向民、邱茂锋、王格丽.本标准于2002年首次发布，本次为笫一次修订。实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南1三a本标准规定了实时荧光磨合酸链反应在临床实验空应用中的样本采集和处理、方法、污染预防和控制、质年管理、结果判读和报告、实的室生物安全、临床适用范国等要求，本标准适用于全国各级各类医疗
6、卫生机岗及医学检验实验室开展核酸犷剂基因定性及定属检测.本标准不适用于基于核酸柒交、核酸忸温扩增、基因测序等技术所开展的检测。2祝范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款.其中.注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修通单)适用于本标准.GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则GB/T4097-1核酸样本侦IiU平价方法JJF1874(自动)核酸提取仪校准规冠JJF1527聚合触跳反应分析仪校准规范WS233病原激生物实脸宓生物安全通用准则WST348尿液标本的采集与处理WS/T414空间质信评价不合格原
7、因分析WST640临床微生物学检紧标本的采续和转运WS.T661峥脓血液标本聚集指南3*BWtX下列术语和定义适用于本标准.3.1XMUtfiPolyaerasechainreaction;PCK一种利用人工合成的寡核甘酸作为引物介导的DNA目标序列特异性解优扩增技术.当存在模板、底物、引初和酎热DM崇合院时，通过调节反应温度引导多次“变性-退火-延伸”反应循环，可令痕DM模板扩增数百万倍.3.2实时55光JR合反应real-timefluorescencepolymerasechainreaction：rcal-tinwPCR在PCR反应体系中引入荧光基团，利用荧光信号的松累实时监测将个PC
8、Ria程，通过连续监测绘制反应动力曲线，从而时样本中被扩增模板叭A的初始含量B行计算“该技术包含定性和定境检测，常以qPCR(qantitativcpolymerasechainreaction)代表定量检测.3.3反转录reverseIraKcriptiaizKF以RXA成做为模板，在反转录的催化下合成互补IAA(UPclXA)的过程.3.4模板template红制或转录.反转录过程中川来产生互补链的DNA或RNA核苻酸序列.目标序列targetsequence拟通过HR技术进行定性或定负检测的特定核酸/列区域.3.69Mprimer具有特定芹列的人工合成寡核甘酸片段,可与目标序列区域上下谢
9、可扑，从而形成检定的氢键连接.促进DNA娘合唧的结合和DNA鞋的延伸“3.7蛇隙针fluorescentprobe根据特定域因序列设计的标记有荧光菸团和泮灭翦用的人工合成分核音酸片段,与互补序列退火杂交后.通过PCR旷增陆促反应择放荧光信号.用于检测样本中是否含仃特定基因序列.3.8SHtdenaturationPCR反应体系中.利用岛源条件破坏核酸二级结构中的城键,使DNA，RNA均从复杂品级结构转变为妓性单槌核甘底的过程.3.9S5annealingPCR反应体系中,需通过降低反应体系温度,使两条线性单铳核首酸通过互补Wl基间的双谴形成同郃双集的过程.3.10SIextensionPeR反
10、应体系中，引物与模板发生退火后,在耐热Dw聚合前作用F,根据模板DNA的破葩顺序，以单个核甘陵为原料，白引物5缆向3端逐个添加核仃酸合成两条互补链的过程。3.11DNA*WMDNApolywrase以DNA单燧为模板、JNTP为原料，催化脱氧核仃酸加到货物或DNAsI的3-OH端，合成互补DNA新糙所得的酣.3.12反转录的reversetranscriptase以RNA为极板指导JNTR合成”:补DNA的聚合称3.13插入insertionDNA或RNA的一种突变出式，在原有核仔酸序列中插入了一个或多个额外核甘酸，3.14缺失deletionDNA或RNA的种突变形式，在原有核件酸序列中丢失
11、了个或多个原有核件酸.3.15抑制物inhibitor/干扰物interferentPCR检测反应体系中抑制或干扰PCR反应进行的物质，可导致PCR产物产业减少或非特界性产物增多.Ccntanimticn由于样本交叉污染或试剂、标准品、质控品、扩增产物污染等原因,导致PCR扩增体系中混入来自待检样本以外的模板，使PCR桧测出现以阳性结果的情况。3.17mplememaryDNA)crtNA游离DNA(CeiIfeDNA)Ct衢环阑曲(cyclethresholdvalue)ciDNA循环肿瘤DNA(CirCUlatingtumorDNA)DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicac
12、id)DNaw脱轧核糖核酸酸(deoxyribonuclease)dNTP脱氧核件三磷酸(dcoxyribonucleosidcIriphosphaic)d,DNADNA(doublc-strandcdDNA)EDTA乙：胺四乙酸(elhyIenediaminaeiraaceticacid)FFPE福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixedDaraffin-e三bedded)miRNA微小RNAso,标准操作程序(standardoperatingprocedure)SSDNA而集DNA(SingIoStrandedDNA)real(i11)ePCR实时荧光聚合演SI反应(realin
13、efluorescencepolymerasechainreaction)rRNA核检体RNA(ribowmalRNA)Tm熔解温度(meltingtemperature)UDG尿啼噪-DXA糖地水解醉(UraCiI-DNA8Iycosylas)5样本果集和史理5.1 总体要求应正确进行样本采集、转运、处理和保存.发生在分析前阶段的操作不当可能会破坏样本完整性.导致核酸降斛，引入污染或干扰物，Ai终影响目标序列定性或定域检测结果的准确性，实验空应就各环节制定详细的技术要求，并向样本采集、转运、接收、检测人员分别提供相应培训.1.1.1.1 实验室在开展实时荧光PCR技术极务时.除常规遵循体外诊
14、断样本采集要求外,还可参照WST661、脚/T348、US/T640进行，应结合不同检测项目对样本的要求，并参考所使用试剂及耗材的说明，制定详细的样木采集程序，包括采样时效、采样部位、样本类型、采样装置与采集容器、采集方法、果样量、质房评价注意事项，并对采样人员提供相应培训与指导.1.1.1.2 采样人员在采集样本的应核对受检者身份、采样部位、样本类型、采样装置与采集容涔.采集完成的样本应予唯一性标识。1.1.1.3 如需受检者自行制取样本（例如痰液、尿液），应指导其如何正确制取并送检，避免因操作不当造成样本质圻不合格、检测结果不准确.5.2.2 *料5.2.2.1 采样时应参考检测r更目要求
15、、疾病特性、病原微生物感染部位或培染细胞类型等因素，选杼采样部位与样本类型，以确保所采集样本中含有悔测目标序列，5.2.2.2 实时荧光PCR技术可检测的临床样本类型包括组织（新鲜组织、石蜡切片祖织）、细胞及其培养产物、EDTA或枸榜酸抗凝全血、干血斑、血清、血发、外周向单个核细胞、骨髓、其他体液（例如脑带液、浆膑腔积液、尿液、房水等）、产前诊断样本（绒毛膜、绒毛膜培养细,胞、羊水、羊水培养细胞等）、拭子（采集分泌物、脱落细胞、微生物等）、分泌物（痰液、脓液、唾液等）.体腔与体表冲洗液（含脱落细胞、CfDNA）、炎使、含微生物的临床样本或微生物培养样本，等.5.2.35.2.3.1 应结合不同
16、检测Il的与疾病特点，明确样本采集的时效性，避免因在疾病发生发展过程中样本采集过早或过咫而导致假阴性结果,好染性疾病可考虑在病程不同阶段连续采样送检5.2.3.2 F术、输血、药物治疗等医疗行为可影响实时荧光PCR检测结果，采样前应明确患并有无接受上述诊疗行为，如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况.5.2.3.3 采样完成后应标明或记录具体采样时制以供回潮,5.2.4 河染*推5.2.41采样过程中应注意避免外源性核酸污柒.5.2.4.2病原微生物检测采样时迸守无菌操作.避免样本被环境微生物和定植微生物污染.5.2.5采样装量和采IM5.2.5.1 应为无菌、无DNagRNa、次性.所用材
17、质与所含添加物不可抑制或干扰PCR检测过程.5.2.5.2 全面和阳秘样本抗凝首选EDTA与拘栈酸盐，不可使用肝素。如何时采集多管样本，应根据采集容器添加物类型及对PCR反应有无影响制定填装顺序，其中,真空采血管采集顺序可参照WS661执行.5.3样本运5 .X1应结合不同样本类型与检测Il标核酸特性，参考试剂盒说明也要求，制定样本转运与保存过程中的时间、温湿度条件及生物安全要求。6 .3.2样本经我集后，应尽可能减少运送环节、缩的游运时间，在规定时间内运达实验室.5.45.4.1 应结合不同检测项目制定各自详尽的样木接收，拒收标准及不合格样木退收流程.5.4.2 对经评估质量合格的样本应收尽
18、收，样本质献评估应充分考虑样本运送时间和条件，不同类型样本的质出评价标准包含以下方面：a）全血样本：EDTA或构株酸抗凝、样本质适宜、用容器、无凝血或溶血：b）血浆（滴样本：样本量适宜、专用容器：c）其他体液：样本愤适宜、专用容器、无污会物：d）拭子：5用拭子、保存液和容器：O组织：样本属适宜、专用容器、保存液.5.4.3 己接收样本应在规定时间内录入实验室信息系统,做好接收登记，便于临床实时查询和追踪样本状态.5.4.4 徉本拒收当样本经评估不符合接收质量评价标准，例如：标记信息错误或不足、样本类型和申请检测项目不符、抗凝方式不当、采集容渊不符合专业规范、破损或产重污染、样本处理或转运不当、
19、样本量不满足检测最低要求，实脸室可拒收样本并做好相应记录，同时尽快通知样本聚集部门，向其解律拒收原因并建议重新采集合格样本，5.4.5 让步检f5.4 5.1特殊情况下如必须进行检测,实验室就样本可抢救程度及检测可行性进行评估后，应就样本可能存在的检测影响因素充分告知临床医师，羟沟通许可后行让步检验并将具体情况详细记录在案，同时在检测报告中箸注样本特殊情况，5.5 5.2叼询在以卜情况的样本不宜进一步行PCR检测：肝泰抗凝血样、无标识/标记福误的样本。溶血及经冰融的全血样本不宜用于CtDNA检测.5.65.6.1 总体要求实施实时荧光PCR依测前，可采用经有效蛤证的技术方法从各类型样本中提取和
20、纯化核酸，制釜成扩增帙板，提取与纯化操作可令核酸物颐作放、提高目标核酸浓度、去除PCR抑制物、提高PCR扩增成功率和可重复性，有利于检测标准化，5.6.25.6.21 总体要求应根据样本类型、目标核酸来源.疾病特点、检测目的,选取适宜的样本前处理方式.5.6.22 K6对样本中特殊来源或植定性差、含收低、易降解的核酸片段（例如RNA、CtDNA）.应及时而心分离相应检测成分，全血样木可经离心后分离血清、血浆、外周血单核细胤，其他体液样本可经而心后分离上潦沉渣.5.6.23 Jft匀抗子、导管等样本可经振荡.使粘附于其表面的细胞菌体、病毒洗脱入样本保存液.5.6.24 4均It化当细胞、曲体、病
21、毒被袤摸或粘附在其它物质内时，可通过均质化使其择故。例如：极液样本宜先消化锋放曲体；粪便样本宜机械混匀：组织样本直典碎研磨,&5.Z5流岬富集对检测目标序列含量较低的样本,应通过适亢技术手段进行分离以实现浓缩和富集,提商检测灵敏度.例如：炎使、尿液、脑汗液和其他体液样本中的细胞可经离心分离：血液及其他体液样本中的特定细胞亚群可经流式细胞荧光分选、横珠捕茯等方法分忘：组织样本中的特定类型细胞可钱激光痛票显激WSIJ获取.5.5.3OSM5.5.3.1 新鲜组织样本可采用均质器打匀、钢珠打磨、液氮研磨等方法对样本进行均质化,可以蛋白除K消化处理.5.5.3.2 化没有新鲜或冷冻组织样本的情况下,可
22、使用中性福尔3林固定石蜡包埋组堀(fbrmalin-fixcdParatTinYmbCddCd.FFPE1样本.FFPE组织切片用于核酸提取前，应羟过脱蜡、乙醉漂洗、风干、蛋白陶K消化处理。5.5.4EIJR与纯化5.5.41MIMI*应根据样本类型、目标核酸类型(DNA/RNA)选择核酸提取与触化方法。首要版则为确保核酸结构完整收，其次为去除其他干扰勒.采取相应处理方法保证核酸的提取质量和产量,以检保满足下游检测要求,实脸室应针时实时荧光PCR检测项目翌求制定并遵照核酸提取与纯化SOP,我用商品化核酸提取试剂盒前，应对其核酸提取效率进行评估，包括核酸纯度、提取产率、完整性.&42DN10R应
23、根据组织、血液、拭子、尿液、粪便等不同样本类型及检测目的选择适宜提取方法.目前临床常用秋珠分离纯化法，该法裔效且易实现自动化，适宜在样本出大的情况下使用。&43RNAm应根据目标RNA类型(总RNA.mRXA.miRNA),下讷检测所儒模板纯度、处理样本耗时和成本、以及RNA完整度要求进行选择.RNA提取过程中应做好环境消毒、操作者臼身防护、涔材预处理，注意避免RNaSC污染,以免RNA降解.主要方法包括：柱提法和磁珠分离法.5.6.5的，5.5.5.1甲苫化位点，甲基化检测需以亚硫酸级盐处理基因组I三.所有未发生甲基化的胞吃哄转化为尿嗡噬.而甲基化胞足保持不变.再利用针对甲基化和非甲基化序列
24、的引物进行实时黄光PCR检测.影响转化的主要因素包括亚硫酸乳盐浓度、反应温位PH值及反应时间，应严格控制反应条件，以保证转化效率.5l5l5c2RNAfiWitRNA需以OIig(XdT)或随机引物经反转录成为CDNA,再进行后续实时荧光PCR悔测，5.5.604皿评价羟上述样本处埋后获得的扩增核酸模板提取产量、纯度和完整度应符合后续检测要求，以满足犷增有效性和结果准确性.具体评价指标及判断标准、方法及操作步骤可参考GB/T37874、GB/T10扩增阻滞突变系统PCR技术亦称等位基因特异性PCR,用于对已知灾变茶因进行检测，该技术设计有两个5端引物，一个与野生型互补，一个与突变型互补。对于纯
25、合性突变，分别加入两种5然用物及3,戏引物进行平行PCR,只有与突变完全互补的引物才可延伸并得到扩增产物，如错配位于引物的3端则徐致延伸反应无法迸行，ARMSPCR法依测灵粒度裔，可检测肿胸细胞中突变比例为隔认至更低的突变艇因。A.1.5高分解率博集曲收技术(highresolutionmdlin,IIKM)高分辨率熔解的税技术是种基于实时荧光PCR的新方法，可用于检测基因突变、基因分型、单核甘酸多态性以及甲基化修饰等,该方法在反应体系中加入了新型饱和染料.通过实时监测升温过程中荧光染料与扩增产物的结合情况，根据不同熔解曲戏形状和位豌来判断是否存在基因突变或SNP,A.2英健基于实时荧光PCR
26、技术的原理,目前还衍生有多种其他类型技术。而于RNA样本，可采用反转录实时荧元PCR,通过反转录的将RNA反转录为CDNA1再进行后续扩增。临床上，反转录案合酹链反应(revenwtranscriptionpolymerasechainrcaction.R-KR技术通常,川于RNA病停检测(例如丙型肝炎病毒、人免法缺陷病有等)以及疾精相关mRNA游录产物的分析(例如非隹奇金淋巴凝、白血病和肉痛等伴随的基因易位等)，此外，甲基化特异性PCR技术(mehyla(ionspecificPCR.MSP)也在临床疾病诊治中有相关应用.同时.的若技术的不断发展.新一代实时荧光PCR技术例如数字PCR技术(
27、digitaiPCR1dPCR)、做流控PCR技术、PCR技术阵列芯片等发展迅速，但在临床应用上仍处于探索阶段，附录B实时蚪PCR技术床建用也I1.1 映相券（中的应用1.1.1 总体M则B. 1.1.1实时荧光PeR技术可宜接检测痫原微生物特异性核酸序列,以此判阍样本中是否含有可疑病原微生物，具灵枇、特异、简便、快隆的优势，布利于疾病的早期快速诊断，8.1.1.2 该技术除用于提供病原学感染的实验室证据外，还可用于病原微生物定母、分型,耐药荔因、基因突变等检测，为蛤床诊疗决策、流行病学监测、院感防控等提供指导.8.1.1.3 在感染性疾病应用过程中应做好鉴别现症感染、既往喜染：污染、定植、条件致病菌等情况.并结合其他检测结果及临床实际，为就原学确没提供分子依据。B.1.2B.1.2.1实时荧光PCR技术可检测病毒特异性核酸序列.以明确样本中是否含有相关病毒.多里实时焚光PCR技术可同步榕测多种新毒，提高呼吸遒、消化遒等呼染院候群的诊断效率.8. 1.2.2结合特定定世标准品参考体系，实时荧光PCR检测结果可用于评价样本中的病毒含电.在临床诊疗中可用于临床病情评估、治疗决策、疗效评价、耐药监测与签定等。8.1 J3因a座定实时荧光PQt技术可针对病毒特异性基因的高度可变区,
