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1、Klinefelter综合征的研究进展2024摘要KlinCfClter综合征(KIindeIterSyndrOme,KS)是X染色体数口异常性疾病，可导致精子生成障碍、生殖细胞丢失，引起男性不育和生长发有异常.KS患者多余染色体造成的基因表达异常和睾丸微环境异常与生精障碍、生殖细胞丢失密切相关，其发病机制尚未阐明。精子冷冻、显微取精术、卵胞质内单精子注射等技术为KS患者生育力保存和生育提供了技术手段，尤其是人造配子技术可能成为KS不育的新疗法，但该技术尚未完全成熟，仍存在安全性和伦理问题。本文对KS的研究进展作一综述，为其诊治提供新的思路C【关健词】KIinefeIter综合征；染色体异常；
2、生育力保存；生殖细胞丢失;睾丸微环境异常KIinCfelter综合征(KlinefCItCrsyndrome,KS)是最常见的性染色体数目异常性疾病，表现为X染色体数目多于1条，最典型的KS染色体核型为47,XXY,其次为46,XY47,XXY嵌合体，少部分患者核型为48,XXXY或49,XXXXY,可导致精子生成障碍、生殖细胞丢失，引起男性不育和生长发育异常。文献报道KS发病率为l660l550,但缺少大规模的中国人群发病率数据1。KS表型复杂多样，但通常包括睾丸衰羯、身材高大和学习障碍等，患者罹患骨质琉松症、乳腺癌、自身免疫性甲状腺疾病和2型糖尿病的风险也增加。KS是男性非梗阻性无精子症(
3、non-obstructiveazoospermia,NOA)中最常见的染色体异常疾病2o超过95%的KS患者难以自然生育，仅有约8%的KS患者精液中存在精子，是引起男性不育的主要原因之一3。因此，KS备受关注，成为研究的热点。一KS的病因KS的直接病因是多余的X染色体，可能导致X连锁基因表达量异常或表观修饰异常，从而出现不同类型的KS表型。随着额外X染色体的数最增多，其临床症状及表型越发典型，而嵌合型KS临床表型不显著，甚至无明显表现Ho1. KS染色体多余X染色体的来源及机制：KS多余的X染色体可能来源于母体卵子发生MI或Mn期间染色体分离失败，或父体精子发生MI期间染色体分离失败，在常染
4、色体三体疾病中，来自父系的分离失败仅占10%左右，而约50%KS患者多余X染色体来源于父系，提示KS有较强的父系倾向lo方学者认为额外的染色体来源不影响KS的症状，也有学者提出来源于父亲的多余X染色体可能导致青春期晚发和延K4o2. KS染色体异常导致男性不育的机制：研究显示KS患者染色体重组强少，影响交叉形成，导致减数分裂停滞的现象5。目前认为KS男性不育的主要机制是多余X染色体导致的X连锁基因剂量异常、生殖细胞核型改变、泉丸微环境异常。(1)多余X染色体导致的X连锁基因剂量异常：随着测序技术的发展，已有许多KS相关基因的报道出现6。已经鉴定出些可能逃逸X染色体失活并影响KS表型的基因，比如
5、KDM5C、ElFlAX、KDM6A、DDX3X、TX1.NG、PRKX、EIF2S3、ZFX等7。转录组学提示KS假常染色体区域1(Pseudoautosomalregion1,PARl)转录物GTPBP6、AKAPI7A、CSF2RA、S1.C25A6、ASMT1.上调，XP转隶物KDM5CZFX、PRKX、EIF2S3、EIFIX,Xq转录物RPS4X二倜，1.AMB2下调8o2021年，1.iU等9报道并证实父源USP26相关突变可提高男性XY非整倍体精F的比例，深入揭示了KS发生的可能机制。团队构建了Usp26破除小鼠，显示Usp26敲除后TEXIl水平降低，导致性染色体无法正常联会
6、配对，Ml期性染色体无法正确分离，产生较高比例的XY型精子，进而增加子代出现类似KS小鼠的风险。该团队确定了两个KS家系，其中父亲携带USP26突变型，子代也患有KS,进一步支持父系USP26基因突变可能导致后代出现KSeXIST是参与X染色体失活的主要RNA,当存在多余染色体时上调以确保剂量补偿,这一点在KS男性中已得到证实。Mahyari等10分析了12例KS患者的单细胞RNA测序数据，显示KS患者青春期支持细胞X染色体XlST基因表达缺失，导致X连锁基因表达就升高10%14%,这可能是KS患者不育的原因之一。(2)生殖细胞异常：KS生殖细胞存在丢失、退化、凋亡、发育受损等现象。2018年
7、，Winge等11通过转录组学分析了8例KS胎儿睾丸,显示在妊娠1822周时已经发生了生殖细胞丢失,但.该研究的样本埴小，需要更多数据来明确KS患者生殖细胞丢失的具体时间。2019年，1.aurentino12通过重亚硫酸盐测序和单细胞RNA测序分析了KS生殖细胞的DNA甲基化模式和转录组，表明KS生殖细胞DNA甲基化谱正常，但印记基因H19区域甲基化水平降低、MEG3区域甲基化水平增加，这些区域的异常DNA甲基化在早.前已被证实与不育有关。(3)睾丸微环境异常：睾丸微环境异常在KS中已被广泛报道，比如支持细胞数也减少和发育阻滞、间质细胞异常增生和功能紊乱、肌样细胞(peritubularmy
8、oidcells,PMCs)蛋白表达异常等。2021年，李铮团队通过单细胞分析表明KS患者支持细胞能喉利发育至成熟阶段,但GO分析显示其免疫应答相关通路激活，找到831个下调的差异基因(differentiallyexpressedgenes,DEGS)和1130个上调的DEGs,差异最大的DEGs有MIF和。2微球能白,提示存在异常免疫激活13。间质细胞功能紊乱对KS生精的不艮影响也是目前KS睾丸微环境失调的重点关注方向。D1.KI是未成熟间质细胞的标志物，在一项纳入3例KS患者睾丸进行单细胞分析的研究中，研究者报道D1.Kl表达显著高F正常对照，提示KS患者间质细胞未能完全成熟14。间质细
9、胞不完全成熟和功能失调会导致睾酮水平降低，无法支持精原细胞生存和分化。TUttlemann等15认为KS患者间质细胞仍可能产生睾酮，但其将睾阳释放到体循环的能力受损，导致KS患者的睾丸内睾酬与血清睾酮的比值远高干唯支持细胞和对照组患者。为证实这猜想，他们构建了41,XXY*KS小鼠模型，显示睾丸组织表面血管明显减少。目前尚需更多的工作来阐明KS患者间质细胞的功能及其对精子发生的影响。PMCs和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白一起构成生精小管的管壁，通常分泌胶质细胞源性神经营养因子，促进精原干细胞(Spermatogonialstemcells,SSCs)增殖。在
10、精子发生受损的男性中，生精小管壁的成分经常发生改变，这表明PMCS对生精彳重要作用。2020年,一项对27例非嵌合KS患者睾丸蛆织活检进行免疫荧光染色的研究显示成年KS零丸PMCS中-平滑肌肌动浅白2(alpha-smoothmuscleactin2,ACTA2)表达缺失、ECM蛋白胶原I和IV表达模式改变16。ACTA2是PMCs收缩标志物，其表达缺失导致PMCs表现出类似成纤维细胞的形态，这为KS睾丸纤维化提供了可能解释。二KS的诊断及生育力评估KS诊断的金标准是染色体核型分析，但该技术无法识别小于10Mb的拷贝数变异(CoPynUmberVariatiOns,CNVs)单核甘酸多态性微阵
11、列(singlenucleotidepolymorphismarray,SNP-array)分析解决了这个痛点，但该技术无法识别染色体结构异常。因此，二者联合可在产前筛查时提高染色体异常检出率。有报道称KS的终身诊出率约为25%,旦超过半的患者在成年后才被确诊loKS主要诊断方法包括临床表现、精液检查、睾丸病理检查、睾丸超声、高分辨率染色体核型分析等多种手段CKS的典型临床表现为身材较高、四肢修长、睾丸硬小、男性乳房女性化，可伴有语言障碍、认知障碍、行为或心理障碍等。青春期前主要表现为男性第性征发育异常和学习障碍，青春期后常有第二性征发育异常，出现性腺机能减退症(体毛稀疏、性欲N降、勃起功能障
12、碍、不育等)。细胞游离DNA分析、荧光定量PCR、多重连接依赖的探针扩增、外周血细胞荧光原位杂交检行等技术能帮助确诊。睾丸病理检查显示育春期后KS患者出现不同程度的睾丸生精小管增厚、退化、纤维化、透明化和玻璃样变，同时伴有不同程度的生殖细胞耗竭、间质细胞增生和血管基底膜增厚,2022年，Deebel等17报道了一项针对KS患者的回顾性队列研究，提出运用MAGE-A4和UCH1.l作为免疫荧光标志物来区分未成功分化的活精原细胞，该方法可能识别H&E染色遗漏的精原细胞。如何更加经济快捷地诊断KS,提高KS的诊断率，以及如何前移KS的诊断关口，找到创伤较小或无创的产前诊断方式，是KS诊断方式更新的关
13、注点。KS患者生育力评估可从多个方面进行，包括精液检查、激素水平检查和睾丸活检等。对于精液中未找到可用精子的KS患者，睾丸显微取精(micro-dissectiontesticularspermextraction,micro-TESE)手术可用于检杳是否有局灶性精子发生。在NOA患者中，卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)和抑制索B水平以及抑制索B/FSH才助于评估生育力，但有研究指出这些指标并不适用于KS患者生育力评估，诊断性micro-TESE依然是KS生育力评估的重:要方式18-1911三KS的治疗1.睾附替代治疗(testosteronerep
14、lacementtherapy,TRT)：KS的主要治疗方式是TRT,推荐患者在青存期开始时即启动睾酮替代治疗，以促进并维持患者的男性第二性征，同时起改善性功能、增加肌肉力好、提高骨密度等效果。睾酮治疗的效果与雄激索受体基因中胞嗑嚏-腺喘吟-鸟嗦哈重复序列的长度相关，主要治疗方式是肌内注射和口服制剂20。除传统TRT外，人绒毛膜促性腺激索、选择性雌激素受体调节剂、芳香化酶抑制剂等也可作为药物选择。已有研究指出，睾酮补充治疗对KS患者不育症的改善无效，甚至在接受辅助生殖技术(assistedreproductivetechnologies,ART)前对精F发生有负面影响21。2KS患者生育力保存
15、：除TRT外，患者生育力保存也是KS治疗中的重要部分。在ART出现以前，KS夫妇常常难以获得属于自己的后代，只能借助精子库供精实现生育愿望。若能在青春期患者精液中检出精子，可考虑采用精子冷冻技术保存生育力。Sun等22建立了种低温精子保存系统，可以方便地保存卵胞质内单精f注射Cintracytoplasmicsperminjection,ICSI)术后KS患者剩余的稀有精子，解冻后精子复苏率为83%,活动精干率为36%。若精液中无可用精子,可考虑通过micro-TESE进行生育力保存。相较于常规睾丸精子提取术，micro-TESE对睾丸的损伤更小，有更高的安全性和有效性，现已广泛用于NOA相关
16、不育男性的生有力保存。约50%的KS患者能通过micro-TESE找到可用精子18。对于首次行micro-TESE未找到精子的患者,仍推荐继续行micro-TESE以发现可能存在的精子。对于多次行micro-TESE均找不到可用精子的患者，可考虑冷冻保存术中获得的睾丸组织C3. KS助学治疗：KS患者曾被认为难以获得遗传学上的后代，但micro-TESE联合ICSI技术已经可使患者实现生育愿望C由于KS精子仍然可能存在染色体数目异常或Y染色体无精户症因子(azoospermiafactor,AZF)微缺失，ICSl前可使用胚胎植入前遗传学检测(PreimPIantatiOngenetictes
17、ting,PGT)技术进行胚胎植入前筛杳,这为KS患者提供了选择雌性胚胎进行移植的可能性，但这项技术会给患者带来高经济负担。在性染色体异常的嵌合体ICSl患者中，胚胎染色体异常的风险非常低，加之PGT对后代的风险仍不完全清是，许多中心不常规向患者建议使用PGT,而是推荐将PGT用于常染色体结构异常的嵌合体，尤其是16q22位点腌弱的患者23。随着二代测序技术(nextgenerationscreening,NGS)在胚胎分析中的应用，KS夫妇可以接受来自micro-TESE的冷冻豆苏精子，通过基干NGS的PGT进行妊娠。一项纳入106例患者的研究提示,KS患者的精f回收率(SPCrmretri
18、evalrate,SRR)为47%,与正常核型NoA患者精子回收率相近。KS患者的受精率在统计学上显著低于正常核型NOA患者，但妊娠率和流产率类似24o研究表明，KS患者成功SRR的概率为42%57%250由于KS患者生殖细胞耗竭是随着年龄进展的，年龄35岁被认为是KS患者精子回收的潜在积极因素。目前指南没有关于KS患者进行micro-TESE的最佳时间推荐,但并不推荐KS患者过早进行生育力保存,而是推荐年龄为1635岁的KS患者进行micro-TESE,原因在于1630岁KS患者的SRR为40%70%,而16岁以下KS患者的SRR较低，仅为0%20%,且有专家认为过早进行显微取精术可能会损伤
19、青春期KS患者睾丸组织，可能对青春期患者产生不良的心理影响260影响KS患者SRR的因素多样，包括术前是否接受激素治疗、术者经验是否充足等，来曲理、阿那曲理等芳香化施抑制剂可能增加取精术的成功率。倘若KS患者首次micro-TESE失败,仍然建议重复进行第二次micro-TESE0近年来，圆形精子注射技术(roundspermatidinjection,ROSI)作为一种新兴的ART方法吸引了学术界的关注。ROSI是在显微镜下选取网形精子细胞，并将其直接注射进入卵细胞得到后代的方法，对治疗KS患者不育可加有巨大的潜力。ROSI尚未在临床广泛应用，主要问题有受精效率低、ROSI胚胎发育潜力降低等
20、，推测可能和ROSI胚胎DNA去甲基化受损有关。同时，关于RoSl的安全性评估仍在持续进行，Tanaka等27-28先后报道了14名健康ROSl婴儿的出生，并对9。名RoSl婴儿展开了为期2年的身体和认知发育随访，认为ROSI婴儿在2岁前与自然受孕婴儿在身体和认知发育方面没有显著差异，这给KS患者应用ROSI生育带来了信心，但该项目尚未给出进一步的随访数据，仍需更多的报道来支持ROSI的安全性。尽管曾有研究认为ROSI对KS生育无效，但该研究的样本量少，时间也很早.29。RoSl技术在近年有许多进步，其受精率低的问题已经可通过联合人工激活卵母细胞技术得到定程度的改善28,30o笔者认为有必要对
21、ROSI是否能帮助KS患者生育进行重新评估，包括KS患者能否通过ROSI获得正常核型的可用精子，以及KS精子产生RoSl胚胎的安全性。除RoSl外，SSCS移植可能在未来用于治疗TESE阴性的KS患者。2019年，Fayomi等31报道自体移植到恒河猴睾丸内的SSCs可产生功能性精乎,并产生后代；2022年，GaldOn等32从KS患者睾丸组织中分离出精原细胞，并成功在体外增殖培养UOd,这为KS的SSCs治疗提供了新的可能性。此夕卜,体外配子发生(invitrOgametOgeneSis,IVG)技术的进展也给KS患者带来新的希望。豉至目前，小鼠IVG已经取得成功，但人类IVG技术尚不成熟，且仍毋要谈慎评估IVG带来的伦理风险33。四.总结与展望KS常常导致男性患者发育不良和不育，其发病机制尚未完全清楚。现有研究多围绕于KS生殖细胞的丢失、成熟阻滞和KS支持细胞免疫异常、间质细胞异常增生、睾丸微环境改变等，后在揭示其病理生理机制。部分KS患者现已可以通过micro-TESE和ICSI技术实现生育，但部分无局灶性生精的KS患者仍无法获得与自己有遗传关联的后代，IVG可能为这部分患者提供希望。如何使完全无局灶生精的KS患者获得自己的遗传学后代，是KS未来研究的关注重点
