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1、附录A（规葩性）流行性出血热血清学诊断方法A.1I理摘获ElJSA法（MacE1.ISA）检测流行性出血热IRM抗体A.1.1原理根据抗原抗体特异性结合的原理.利用抗人U疑特异性抗体捕获待检测血清中的EM抗体.加入的标病毒蛋白抗原，也可加入病毒蛋Fl抗原或灭活病毒与相应的图标特弁性抗体,反应后加底物显色或发光。显色程度或发光强度与特异性IgM抗体含量型正相关。A.1.2标记抗原法A.1.2.1材料和试剂材料与试剂如卜，可根据所选用试剂盒的不同有所增诚。a）洗板机、解标仪、恒海骅箱或水浴希（372Cb）101.-200U1.可调移液零、IOm1.吸管.c）植祥血清用的试管、吸水纸.d）然憎水或去
2、离子水，e）洗液（PBS-T：磷酸皓缓冲液,含0.05%吐温20,pH7.2,f）流行性出血热I弱抗体捕获E1.ISR渗断试剂盒。A.1.2.2检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，检泅步骤如F.a）将阴、阳性对照血清.待检1批的Il梯择液按1:K）Cl稀择.加入已包被抗人U燧抗体的胸标板中.1001.fl4,置37C孵育1h.同时设空白对照.b）弃去上清，用PBS-T理洗5遍.C）将适当稀柞的科标记的病毒抗原加入反应板相应孔内，100H1./孔，37C羽有1h.创他与阴性对照孔仆OD值处于预测危围，PN2.1,对照成立：若待检血清孔Oim与阴性对照孔OD值比值32.1,则标本为流行性
3、出血热IgM抗体阳性,反之阴性，,实时荧光定It逆转录聚合曲链式反应（quantitativeReal-tieRT-PCR,qRT-PCR）、翳因测序或其他经过评估合格的病毒基因加核酸检测方法进行检测，检出特异性病毒核酸具有确诊意义8.1流行性出血热痛雷RTfCR法核酸检测8. 1.1原理PCR技术是在特异性引物存在的条件下，利用双链DNR分子破玳配时原则，在体外扩增DNA片段，其特异性取决于界核甘酸引物的序列，引物与待扩增片段两条琏西段DNA序列分别互补结合后，在DNA聚合解催化下.引导引物的5端向3端方向延伸合成新融.是温度控制下可重复进行的热变性、更性延伸的温控循环过程,可使DNA产股呈
4、指数上升.汉坦病毒为负性RM病毒,PCR扩增检测前需经过逆转录前作用，合成第一条CDM链,再进行PCR扩增,呻RT-PCR.设计不同特弁性引物可犷增不同种汉坦病毒基因。从患者标本中提取衲毒法因俎RN,利用适当方法进行核酸检测，可通过扩增片段大小赛定、基因如序列比对分析、特异性引物探针序列等方式，达到就原体鉴定和基因分鞭目的。B.1.2试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增M,a）急性期患者血标本或分岗的汉坦病毒：b）RNA提取试剂盒：c）汉坦病毒核酸扩增引物及分型引物（表B.1）：d）逆传录与PCR扩增试剂食.e）砂液器（10U20M1.100u1.200u1.10001.及配
5、套吸头、PCR反应管、离心管（1.5m1.）及管架、台式高速小心机、普通冰箱、旋涡混合潺、PCR扩增仪等。表&1流行性出血热病毒RT-PeR法核酸检测及基因分型参考引物序列引物名称引物序列（5,-3）片段大小型别HantaV5-GGAeCTGGTGCCKrTGTGAACC-349ObD通用IIiinliiSK5-ACCICCAACGVTGAA(X3IITXG1I5TGCAAoGGGGAGAGGAAMT-3242bp汉港IirxClR5,YTAcrGATmAarTATCTCTSEX11F5*-TG1AATGGTCAGAAGK-3287bp苜尔SEOGlR5CGTAG1UTGGCrnGftATCG
6、Gn3,8. 1.3桧测步艰应参照所选用试剂盒说明书进行相关检测,参考步骤如下.a）病毒RA的提取：按试剂说明书操作，制备模板RNA.b）逆转录合成CDNA：可用防见引物或病毒特界性引物，按商业化逆转录酬说明书进行，c）PCR扩增：根据实脸室内所使用杭华核酸PCR扩增试剂盒特点，通用型正、反向引物配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增.推荐反应条件为94C预变性2min.然后94C变性30s,55TC退火30s.72C延伸1ai11.反应40循环.最后72C延伸10min.第二轮分型PCR扩增体系航置采用分型正向引物与a）病毒RNA的提取：按试剂说明书操作，制法模板Rb）实时荧光RT-PC
7、R扩增：实时荧光定量RT-PCR扩增反应配附体系，参考如下；RNA模板5M1.,酰0.5Jl1.缓冲液12.5u1.引物各0.5JI1.供2对,4条,浓度为20D,探针各0.25U1.加水至总体枳25u1.推荐反应条件为50C30min.95X?2min.95C15s.60C30S反应40个循环.具体反应体系可根据所使用的试剂和荧光PCR仪器进行优化隅整.82.4结果判断以灵光PCR反应的前3个15个循环的荧光信号作为本底信号以本底信号标准差的10倍作为荧光阈伯，标本扩增产生的优光信号达到荧光网值时所对应的循环数为循环阈值Ctft）.以C38可判断为阴性，CI伯处于3538之间者，可判断为灰区
8、，管采用另一套引物探针或其他检测方法进行检测判断8. 2.5意义排除污染后，检出病毒核酸可确诊汉坦病毒整鎏，用于早期诊断，阴性结果不能排除衲毒感染.83病毒分离8. 3.1原理韧毒不能独立生存，需依赖宿主细府完成白我发制.VeroE6和Yero细胞时汉坦病毒敏感，可用于汉坦韧毒的分离、培养，一股不产生显著病变，可通过观察细胞.内和培养上游中，衲毒蛋白抗原和核酸的变化情况,检粉病毒的存在和鞭别.汉坦病毒的分离培养需在生物安全二级或以上娘别实脸室内进行.B. 3.2试验材料材料与试剂如下,可根据所在实验室的习惯与规程有所增诚。a） 101.-2001.1ml.移液零、无雨吸头.b） 96孔、24孔
9、组织培养板或T25细胞培养就或细胞培养管.c） VeroE6细胭或其他敏感细胞.Ver。E6细胞一般较其他细胞敏感.d） CG培养箱、生物安全柜、倒芮显微镜。e）细府生长液、维持液与Hanks液。f）患者血标本或宿主动物标本.无曲采集发病后5d内静脉血3m1.,置冰点中，于实脸室中分围血清,接种细胞培养：不能及时接种细胞在可置701C保存.污染的血清要先用双抗（能及素、链寄素.最终浓度各500000U三l.）.C2h处理后接种细胞.B3.3实验步骤可根据所在实验室的规程有所调整.具体步骤参考如下：a）样本处理和稀糅：忠者急性期血清标本适当稀择后（如1:10、1:20等）可直接用于病毒分离.在病
10、毒细胞培养分离设置一个正常人血清同样比例曾择作为阴性对照.b）细府接种：将培养好的Vero-E6或Yer。单层细咆上清充抖，JWlankS液洗涤2遍，HJHankS液1:10确律的早期血清乐本0.5m1.lml.接种T25细胞培养瓶中长成单层的细胞，在37C温箱吸网2h后用无菌HankS洗涤细胞层12次.每次5ml.,蜃后加入维持液5ml.37C培养.每隔3d4d换培养液.c）培养至第K）d-14d刮取少Ift细胞点抗原片进行免役荧光检测.如果荧光检测阳性,则收集上消接种新解细胞进行病毒培养，确定病毒型别：如果检测结果仍为阴性，则收集培养液,冰存于-7（TC或液氨中以备重新检测，细胞需继续传代
11、。1）连续传代：用腆的消化以上步骤中检测为阴性的细胞，用3三1.4ml.新鲜培养液悬浮细胞，取1/2（1.5m1.2-U细胞悬液与大约同等数琏的新鲜制备的正常细胞联合培养,重亚步骤（O.检测至第3代.取剜余2（1.5m1.-2ml.）细胞悬液禹心后保存于70C待查“e） 病毒抗原和核酸检刈：刮取少成细胞制备抗原片,利用汉用病毒特异性抗体进行免授荧光检测，如果灵光检测阳性，说明存在病毒红利，应参照汉坦病毒核酸检测方法，提取核酸，进行序列分析，并妥善保存。连续传代至第3代，检测仍为阴性者，可判断为阴性，相应培养物可按废弃物处理。f）废弃物处理；所有实验用品都应严格按照有为实骁空安全管理条例处理方法
12、高压处理,83.4结果判断结果判断规则如F：a）免授英光法检测用于分离汉坦烧毒细胞，着受光呈阳性，提示在细胞中有汉坦病毒史制，若阴性，提示细胞中未发生病毒显著或制。b）用于分离汉坦病毒的传代细胞中，病得基因组核酸检测阳性，提示在细胞中有汉坦病毒复制,若阴性提示细胞中未发生病毒显著复制.B3.5意义阳性结果，表明患者汉H!病毒感染；阴性结果,不能排除诊断“附录C(资料性)流行性出血热病原学临床及流行病学资料C.1质原学可引起流行性出血热的汉坦病毒分类属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae哺乳动物汉坦病毒亚科(MaimKintaVirinae)正汉坦病毒属
13、(Orthohantavirus),为有包膜的分节段单股倒链R*喻以，成熟的病用颗粒具有多形性，多呈网形或卵圈形,直径在75n三-210nm.平均直径约为120n三.基因组由JM和S三个片段组成.目前已分类的正汉坦病毒有38种，在我国漉行的汉坦病毒主要为首尔病毒(SeoulOrthohantavirus)和汉滞病毒(HanIaanOrIhohanIaVinJs)，宿主动物分别为福家M.和果线姬鼠,在棕甘辟等啮齿类宿主动物中还发现普马抗病毒PuuinalaOrthohantavirus)等其他种类汉坦病毒,但人间感染情况及致病特征尚不明确.汉坦病毒对一般有机溶剂和消毒剂敏感，飘仿、丙胡、B-丙内
14、酯、酸(PH小于3)、茶的、甲醛等均可灭活，对温度、放射跷、紫外线等敏感，60C30min,粘VO及紫外级照射可灭活。C.2临床表现人搏染汉坦病舟后，潜伏期-殷为4d45d,多为7d14d.表现为急起发热，早期症状包括发热、头痛、寒战、肌癌、愁心、呕吐、腹痛、腹泻等,程度不同的面部和结膜等充m衣现，以及球结眼、腺F皮肤出血点等出血表现.累及肾脏,疾病的严垂程度多取决于所感染衲毒的种类，汉滩烧毒路案引发疾病一般较虫，首尔病毒感染病例大部分临床症状较轻，临床分期不明显,但也可引起严.用疾病：普马拉就毒炒染一般引起轻微疾病(精死率V1%).主要在欧洲潦行称为流行性肾病.该病的典型病程表现为五个临床阶
15、段：发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢垃期，轻症衲例可存在越期现象，不出现低血压休克期、少尿期，Hi旋病例可有病期虫丧现效，即发热期、低血压休克期和少尿期相守.重段。发热期特征是商热、头痛、牌痛、眼眼痛(三痛,全身不适和自欲减退.可出现严型的腹痛,经常伴随恶心、呕吐,面部、颈部和全部潮红(三红)，皮肤淤点和结膜充血,可持续3d7d.低血压休克期可持续几小时到3d,特征是退热时发生低血压，可导致休克和更明显的出血去现。少尿期可在物后3d10dill现.特续2d5d,血压修复正常或偏右,纳茏、恶心、呕吐可继续存在，会发生产取出血和尿量急剧减少,大多数死亡病例发生在低血维休克期和少尿期.出现多
16、尿预示着开始恢亚.尿盘可达到每天31.61.,恢复期可持续数周至数月.C.2.1发法期发热期可出现发热、全身中毒症状、毛细皿管损害表现、片描害表现以及肝脏损害等临床表现.a)发热：起烧急骤，体温般波动在38C皿C,可超过KrC,可伴有我黑、塞战.也有体温媛慢上升者，发病2d3d后升至40C.热型以侑用热和电米热多见，少数为不规则热型.热程可为2d-13d.多持续3d-6d,平均5d.一般患者体温升高程度和扑续时间与病情轻型密切相关.轻型病例及家鼠型患者.常干热退后,病情减轻.中、重型病例热退后病情反而加剧.b）全身中毒症状：去现为困倦无力，全身肌肉关节酸痛：食欲减退、恶心、呕吐、腹痛及眼皆等消
17、化道混状，可因剧烈腹痛、腹部压痛及反跳痛而误诊为急腹疥，亦可因股涓或拈液血便诊断为中毒型细菌性痢疾.重症患者可出现嗜睡、烦躁、诞安及抽播等神经精神症状.c）毛细血管损杏表现：充血、渗出和出血现象，“三红”表现为颜面、颈部、上胸部皮肤如著充血，潮红，似酒醉貌：也可见眼结腴、舌尖及舌乳头充血、潮红。水肿为本标的特点.可出现皮下水肿、球结膜水肿或胸腔积液、腹水,出血我现为欣粉、口腔拈膜、眼结股以及皮肤出血点，典型出血点分布在软腭、放下、前胸及后背部皮肤，呈条索样、挠抓样或申珠样磁点或嫩斑，亦可有出血、咯血、血尿及消化道出血。（1）有脏损击表现：发病后第2d4d即可出现，主要表现为蛋白尿、镜卜或肉眼血
18、尿,尿中服状物、管型尿和少尿.e）肝脏损害表现：尤其在姬瓜型汉滩病毒感染患乔中，可出现黄疸，转级商增高,甚至我现为抒发里肝炎.C.2.2低血压休克期多发生在发病后第4d6d,一般出现在退热前Id2d,或热退同时血压下降，轻者持续数小时,呈一过性血压下降，虫者可捺续数天,一般为1d3d,低血压休克发生率差异较大,轻型柄例可不出现，家尿型患者发生率低且程度轻，此期发热渐退,但其他疝状反而加理.开始血压下降时四肢尚温暧,的若病情发展可出现面色在白、四肢厥冷、发组、脉搪细明甚至触不到，尿量减少，并可因胭供血不全而出现谢妾、烦躁共至神志不清，C.2.3少尿期多发生在发病后第5d8d,可早在第3d,迟至第
19、IOd出现.一般持续2d-5d.轻型可越过此期，亦可与低血压休克期mi时存在。有的患者从发热期直接进入少尿期，或表现为发热、低血压、少尿三期重段.此期临床衣现为急性忏衰竭，出现尿毒症、代谢性酸中毒、电解质紊乱等,并可有产重的高血容量综合征,表现为表浅静脉充盈,曲压增高.脓质差增大，脉搏洪大及血液稀株的表现等，可出现心力衰竭,肺水肿和脑水肿等.少尿期是本病的极期，易出现一些并发正如浮盍的细倒或真的感染、呼吸货堀、呼吸好迫综合征及大出血等.C.2.4多尿期多于病程笫9d-lldHl现，少尿期末，尿依逐渐增多,持续8d12d（个别可达数月。可分为三个阶段，即移行期.多尿早期和多尿后期，a）移行期及多
20、尿早期：此二期尿谕可增加至每天21.,但肾小管功能尚未恢复，血尿素及血肌酊仍异常或继续升高.症状及病情仍严曳，仍可发生少尿期的各种并发症而死：.b）多尿后期：尿；*不断增加，至每天31.以上，多为41.61.可达1。1.以上。此时氮旗血症及临床疾状均逐渐好轴,但亦存在因多尿造成的水、电解麻紊乱，如脱水、低血理、低血钠等,亦可发生维发感染及多渊宫衰帽等并发症.约40-95%患者出现多尿,有些患者在发热期后，不发生低血压休克期、少尿期而直接进入算尿期，也有患拧无多尿期.C.2.5恢复期多在病后3周4周开始饮亚.尿盘逐渐减少并接近正常,每天尿fit21.左右.食欲增强.H至出现色欲亢进，体力也逐渐恢
21、笑，各种实验室常规检查指标基本正常.部分曳症病例的修复期可长达半年以上。C3流行性出血热格床检查C.3.1血常规血常规检测常见白细胞许数、血红蛋白和红细胞以及血小板计数异常。a）白细胞it数：早期白细胞数低或正常.在第2d-3d逐渐升高,可高于15X1071.-30Xltf7l.或更高，早期中性粒细胞增高,核左移，有中毒颗粒，4d5d以后淋巴细胞增高，并可出现异型淋巴细胞，虫症患者可见幼稚细胞呈类白血病反应.b）血红蛋白和红细胞：中于血浆外灌,导致血液浓缩.血红蛋白和红细胞数可升高达l50g1.以上.在少尿期,高血容破综合征时可表现为血液稀择.c）血小板计数：从发烧后第2d起开始减少，一般在5
22、0X10/HOXlO九左右，并可见界里血小板，室症患者可VIoXIO儿。C. 3.2尿季规常见尿常规检测异常表现如下：a）可有肉眼血尿和尿中胶状物，尿中小片状膜样物系由尿蛋白及脱落的上皮细胞如成。b）尿常规摊检可见尿蛋白、红细胞、白细胞和管型.尿蛋白常于病程第2d出现,发筑第4d6d尿近白常达+-“+”.c）尿沉渣中可发现巨大的融合细胞，可能是病毒感染引起泌尿系统细胞融合脱落而形成.在融合细胞中可检出汉坦病毒抗原.C.3.3血液生物化学检查常%IfH液生物化学检件异常表现如下：a）血装尿素觌多于病后3d4d升高.理症病人升高明显：血肌肝含量增高,与血中尿素氮变化一致，较尿素l敏感.b）:氧:化
23、碳结合力普遍下降，肾功能损书越产班，下降越明显。c）肝功能：多数患者出现肝功能异常，可有A1.T升高、血总胆红索升高。可见心肌悔学指标异常.C.4流行病学C.4.1传染源汉坦病毒宿主动物主要包括啮齿目、色虫目、狼形目、自肉目及佃IMi目等,病毒分布具行一定地区特异性，带烧毒哦齿类动物是流行性出血热的主要传家源,我国已发现6。余种升椎动物可呼染汉地病患，以缥线姬就、羽家鼠为主。其次，是以家栖为主的小家鼠、黄胸翻，财栖的黄毛取、大仓融和黑线仓出以及林区的大林姬鼠、小林姬秋等带毒率也较高,可在病祢传播中发挥作用.实胎用大白网被适杂后可成为传桀海.其他哂齿类动物多届于次要宿主动物或偶然出象者，流行病学
24、意义有待进一步评估，猫、犬、猪等京养动物在特定条件下也能感染精毒，但作为传染源的意义小。C.4.2传播途径流行性出血热可通过多种途径传播，以动物源性传播为主，a）呼吸道传播；吸入携带病毒的喷齿类动物排泄物和分泌物（尿、彝便、唾液）的气溶股被认为是主要的传播方式。b）接触传播：直接接触携带病毒的哨齿类动物排泄物、分泌物，或被带病毒的哦相类动物咬伤，病毒经由破损的皮肤或纵腹侵入人体。c）经消化道传播：食入被携带病毋的啮优类动物排泄物、分泌物污染的水和食物，可能造成汉坦病毒经1-1腔或消化道钻腴侵入人体.d）媒介传播：帚病毒的不蛾、恙蛾叮咬人体也可传播流行性出血热.革蛾主要包括格氏血厉螭、厩其厉蜻、
25、耶氏厉螭、破脱毛厉螭、柏氏禽副靖等：志蠕主要为小脂纤念燃，e）有研究提示，孕妇礴染汉坦病毒,存在通过胎盘将病毒传给胎儿的风险，未见其他人一人之间直接传播的报道.C.4.3人群易感性和免疫力未免疫人群普诩易感，心柒后可获得持久的免疫力，群有再次感或发病者，人群免疫接种资料证明，灭活疫苗接种是个人预防流行性出血热的有效手段。C.4.4流行病学特征血清流行精学调杳证实,汉坦病得早.全球分布，尤其是首尔病毒.世界上有30多个国家发现忏擦合征出血热,主要分布在欧亚大陆，其中发柄加多的国家为中国、俄罗斯、朝鲜、芬兰、瑞典、挪威、波兰等.亚洲发病率最高病例数占全世界的9伙以上.其次为欧洲约占7%,非洲和美洲
26、不足1化C,4,4,1地区分布病例分布高度分散，在我国呈全国性分布，又相对集中,近年来，陕西省、嘱龙江省、山东省、辽宇宙报告病例数较高，其次为湖南、湖北、江西和古林等省份。宿主动物地区分布的不均的，决定了辩个省、市（地）、县（区）、乡M,洪至每个村赛的人群发病的分布不均衡,而宿主动物地区分布可因食物和温度等条件的改变而改变,但我就地分布又有相对稳定性.C.4,4.2年龄、性别、职业分布各年龄组均可发病,青壮年居多,男性多于女性.职业以农民为主.年龄、性别、职业上的分布差异主要与接触传染源的机会有关.C.4,4,3季节性全年均有病例报告，具有季节性呈现春夏季和秋冬季两个发病高峥,春夏峰多在5月或6月达到顶峰，秋冬好多在Il月达到顶峰,般秋冬峰高于春爱峰.不同地区，发病季节性分布特征有所差异，季节性分布特点与鼠类繁殖和人群活动有关，C.4.4,4流行类型我国根州引发病毒透染的宿主动物不同，将流行区分为三型.a）姬以型：主要分布在农作物区和林区，传染源以黑线姬鼠为主，临床病情较虫，病理发为典型。b）家取型：主要分布于城市、市郊,以褐家就为优势鼠种,可里暴发流行.流行强度多大于姬胡型，病例性别、年龄差别小，临床病情一般较轻.c）混合型：同一地区同一时间可有上述两型出血热的流行，
