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1、一验证方案起草说明 高效液相色谱是当今应用最为普遍的分析技术，HPLC系统通过可重现的溶剂输送、进样、高灵敏度检测及工作站的数据分析，可得到优异的定性和定量分析结果。为此，本化验室采用高效液相色谱法，对产品进展纯度检测、分析。整个检测过程从溶剂输送、检测到结果分析，全部由电脑控制，自动完成，溶剂脱气采用超声波脱气、进样由手动进样器完成。二验证方案简述高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱，在柱各成分被别离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。我们根据高效液相仪的使用要求,参考
2、HP之OQ/PV以及实际需要对仪器以下关键参数进展测试，以确认HP1100系列高效液相色谱仪是符合设计要求的：1. 波长准确度测试2氧化钬测试3.检测器线性测试 4杂讯测试 5.柱温箱温度准确性测试6.流量准确性测试7.手动进样器准确度与穿插污染测试三验证报告的编写和批准签名1 验证小组成员四验证目的：确认HP1100高效液相色谱仪符合设计要求，能为中间产品检测提供准确的分析数据。五验证围：1 通过波长准确度测试,氧化钬测试，确认UV检测器的波长准确度。2. 通过检测器线性测试，确认检测器在操作吸收度围最大到2AU有线性应答关系。3. 通过杂讯测试，确认检测器及单元泵系统之系统杂讯操作在可承受
3、的规。4. 通过柱温箱温度准确性测试, 确认柱温箱的温度在合格规是准确的.5. 通过流量准确性测试/准确度测试，确认泵系统所输送的溶剂体积在可承受规值，且无大的流量误差。 6通过进样器准确度与穿插污染测试，确认手动进样器的准确度在可承受的标准围， 各次注射间样品的穿插污染前次注射所造成的样品污染在可承受围之。六名词解释RSD%相对标准偏差，本方案中主要是计算标准A前5针的相对标准偏差。 RSD%2.0%。D% 相对偏差的绝对值,本方案中D是标准A5针校正因子的平均值A与标准B3针校正 因子平均值B的相对偏差的绝对值，D%2.0%。检测限LOD试样中被测物能被检测的最低量，以信噪比为2：1时，相
4、应浓度确定检测限。定量限LOQ试样中被测和能被定量测定的最低量，以信噪比为10：1时，相应浓度确定量限。W/W 用已确定的检测限或定量限与样品检测时的浓度250.0mg/ul比较，得到的比值。别离度R 谱图中相邻两峰的别离度。七.相关文件 文件名称 存放位置 八验证具体步骤81验证用仪器、设备的校正HP1100高效液相色 谱仪，包括：单元泵： 手动进样器： 柱温箱: VWD多波长检测器：8.1.1仪器情况仪器名称仪器型号仪器厂家仪器编号仪器精细度高效液相色谱仪HP1100水银温度计0-1001/万电子天平AEG-120G 填表人/日期：8.1.2验证用仪器校正情况和结果仪器名称校正日期校正结果
5、校正有效日期校验单位高效液相色谱仪水银温度计1/万电子天平 填表人/日期：8.2验证用试剂的准备试 剂 名 称来 源100% 纯水水处理室咖啡因Caffeine标准品组美国惠普 部门： 填表人/日期：83验证步骤8.31验证的准备工作（1） 将限流毛细管HP物料编号 5022-2159 安装到装色谱柱位置。（2） 开场OQ/PV程序前24小时翻开检测器灯管，到达最正确的检测器稳定性的状态。（3） 将管道A注入纯水。（4） 翻开分析管柱温控箱的开关，将两个热交换器的温度设定在40。（5） 把温度表探头安装在柱温箱的热交换器上。（6） 翻开清洗阀，以5ml/min流速将A管道至少清洗10分钟以上。
6、（7） 关闭泵与清洗阀。（8） 调节流量1.0ml/min的纯水100%通过检验器，继续其他安装程序待系统到达平衡。（9） 将OQ/PV咖啡因标准品依照表1的位置装到手动进样器旁边。832 波长准确度测试原理波长的准确度可利用测定一其光谱的化合物来加以得知。在特定的波长下，光谱*一特定波段一定会出现，此一波段与特定波长的偏差则可视为检测器的不确度。本测试所用的标准品为浓度25ug/ml的咖啡因溶液。咖啡因在272 nm波长时有最大吸收，而在244 nm有最小吸收，这两个波长即用以验证UV检测器的波长准确度。可变波长检测器VWD：先在水流过检测器、流动池时作一空白扫描，然后以自动进样方式将咖啡因
7、注入流动池中。作波长扫描，空白光谱会自动扣除。设备HP1100系列的单元泵，手动进样器，配有温度控制之可变波长检测器。测试条件方法：HP OQ/PV之波长准确性测试.流动相A：纯水。流量1.0 ml/min。. 柱温箱温度：40。. 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 标准品*325ug/ml咖啡因，用注射器按编号注射到手动进样器里。.运行方法，其结果自动记录并显示测试结果。测试评估所测得最大/最小波长与预期的最大/最小波长之间的偏差会自动计算，测得结果列入OQ/PV报告中。认可标准及结果名称最大波长1最大波长2最小波长最大偏差标准2.0nm2.0nm2.0nm测定值测得最大偏差结论 签名
8、/日期： 复核/日期：8. 3. 3Holmium O*ide 氧 化 钬 测 试(检 测 器)原理检测器波长校正准确度可以借助测量一化合物的光谱来加以求取，在特定波长下，光谱应该显示特定的波段，此一波段与给定波长间的差值，即可视为检测器的不准确度，建具有最大特性吸收的氧化钬滤光器则可用于决定波长准确度。可变波长检测器VWD：VWD利用以下氧化钬的三个最大波长来测定波长准确度：.360.8nm. 418.5nm. 536.4nm氧化钬测试会进展建氧化钬滤光器的扫描,求取最大吸收波长与期望波长之差值, 为了防止吸收溶剂的效应，此一测试是在流动池充满水的情况下进展。设备HP1100系列的单元泵，手
9、动进样器，配置Chemstation 控制的可变波长VWD检测器认可标准波长准确性2.0nm测试条件方法：HP OQ/PV之氧化钬测试. 纯水置于管线A中. 100% A，流量1ml/min. 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱之温度：40。测试评估准确度可由最大吸收时的测量波长与理论波长的偏差来检定。在特定波长围, 测出最小及最大光源强度，并自动与合格规值作比较，结果将列验证报告中。认可标准及结果 要求值 (nm) 标准差值 测定值(nm) 测得差值 结 论 3608 2.0nm 41852.0nm 53642.0nm 签名/日期： 复核/日期： 8. 3. 4检测器响应线性测试
10、原理当光吸收的量超过*一限度时，吸收检测器即呈现非线性现象。造成非线性现象主要原因是散光，在较高的吸收时，散光变得重要，对检测器的应答影响就愈重要。线性的测试方法是在不同样品瓶中放入不同浓度的咖啡因标准品依序增加浓度，每一样品瓶注入屡次，每次注入一样体积，色谱图应该得到面积愈来愈大的波峰，当这些波峰的面积或高度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。设备 HP1100系列的单元泵，手动进样器，配有温度控制的可变波长检测器。测试条件方法：HP OQ/PV之检测器线性测试顺序：。进样量：20ul管线A：HPLC级纯水流量1.0ml/min限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。标
11、准品*1，*2，*3，*4，*5依序放在手动进样器旁边1、2、3、4、5的位置上。. 检测波长：273nm测试评估将所得波峰面积或高度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线，实际上就是强迫通过原点，线性回归的一条校正曲线，此一校正曲线的相关性相关系数即可作为测量检测器的一种判断依据。此直线斜率的倒数即是列印在校正表格中的应答因子。理论上每个浓度下的应答因子应是一样的。因此针对这些应答因子所得的相对标准差即可作为测试检测器线性的另一判断依据。认可标准及结果 相关性标准0.999位置样品名针数样品浓度/峰面积标准浓度 结 论1咖啡因110.5ug/ml2咖啡因211.0ug/ml3咖啡因315ug
12、/ml4咖啡因4125ug/ml5咖啡因5150ug/ml 签名/日期： 复核/日期：以峰面积与浓度可作出图如下： 样品名称：咖啡因Area 检测波长：273nm相关性：公式：Y=m*+b m: b: *:Amount(ng/ul) Y:Area Amount(ng/ul)835杂讯、温度稳定性测试检测器、柱温箱 A 杂讯测试原理杂讯，偏移及偏离是检测器的特定性能。在分析极微量化合物时，检测器的杂讯低与否就显得特别重要，偏移及偏离值对积分的品质影响最大。紫外线/可见光UV/Vis吸收检测器的杂讯是采用ASTMASTME19.09方法来测试，ASTM杂讯测试是根据美国国家标准协会对测定液相色谱仪
13、所用可变波长检测为之标准程序。为尽可能测得实际的杂讯，选用水作测试溶剂因为大多溶剂组合中都会用到水，所选用的波长也是落在常用的波长围。偏移根本上是温度所造成的，其主要的影响是在灯管热机时约1小时，在进展ASTM杂讯测试时，为防止温度偏移的效应，必须至少在24小时前翻开灯管。B 度稳定性测试原理为测试温度稳定性，在杂讯测试时即可使用一部温度感测器将温度不断记录下来。理论上，在测试过程中，温度讯号应该保持稳定，最大温度与最小温度的差距即可视为温度讯号的稳定性。设备HP1100系列单元泵，手动进样器，配置有Chemstation控制的VWD检测器。测试条件方法：HP OQ/PVHPLC级纯水置于管线
14、A中. 100% A，流量1ml/min，运行时间：20分钟. 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。测试评估首先，将讯号以每一分钟为区隔切割成20等份，每一等份的偏移可由回归线的线性斜率求得。其次，各时间等份平行线的波峰到波峰杂讯垂直距离可视为经偏移校正过的波峰到波峰杂讯，所有波峰对波峰杂讯的平均值即为杂讯值。偏移值是指20个时间等份平行线斜率的平均值。偏离值的求取是将20个时间等份的中点连起来，将杂讯计算方式应用于此线即可求得。所得的基准线杂讯、偏移及偏离值、设定温度的最大偏差值与可承受的标准相比较，自动与OQ/PV系统建立时所定义的合格规值相比较，测试值会列入OQ/P
15、V报告中。认可标准及结果测 试 项 目承受标准限制测 试 结 果结 论杂讯, 温度准确性ASTM 杂讯mAU0.40偏移mAU0.2漂移mAU/h0.5温度稳定性左 0.5温度稳定性右 0.5 签名/日期： 复核/日期：杂讯测试结果 时 间杂讯杂讯杂讯漂离漂移温度稳定性由(分) 至分(6*SD)mAU(Ptop)(ASTM)(mAU)mAU/h左右签名/日期： 复核/日期： 8. 3. 6柱温箱温度准确性测试柱温箱原理温度的准确度是借助一已事先校正过的外来温度计来检测，此留点温度计附在柱温箱热交换器的测量点上，待系统平衡后，便读取温度计的温度，将此温度与柱温箱设定温度相比较，并检测两者之差距是
16、否在合格围。此测试取25，27，40，60，65五个温度点。设备HP1100系列单元泵，手动进样器，配置有Chemstation控制的VWD检测器。测试条件方法：HP OQ/PV. 纯水置于管线A中. 100% A，流量1.0 ml/min. 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。测试评估评估包括将外部温度计所量的温度与柱温箱的设定温度相减，比较差值是否在合格规值。认可标准及结果设定温度标准偏差测得温度差值结论左 右左 右左 右25304050556065 签名/日期： 复核/日期：837流量准确度/准确度测试泵原理流量被定义为一定时间被送出的体积量；在HP1100系列的泵
17、系统中，流量则被定义为活塞推送的速度。确认流速的方法是将检测器的出口端直接注入一重量的容量瓶，通过测量单位时间容量瓶重量的变化而折算出溶液的体积量。设备HP1100系列单元泵，手动进样器，配置有Chemstation控制的VWD检测器。秒表：NO：0011322100ml校正的容量瓶测试条件方法：按设定的运行时间，检测器波长254nm顺序：流量0.5ml/min、1.0ml/min、2.0ml/min、3.0ml/min . 纯水置于管线A中 . 流量1.0ml/min. 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。测试评估将在不同时间检测器出口收集到的溶剂量-一体积可用以计算流
18、量准确度，测量的流量与其设定值比较。认可标准及结果认可标准准确性5.0%准确度RSD%0.5%流量准确性测试结果-1 流量： 0.500ml/分钟 压力：29.7bar序号容量瓶重g时间 (s)瓶重+水重g水重(g温度(密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均流量ml/min：RSD% 签名/日期: 复核/日期:流量准确性测试结果-2 流量：1.000ml/分钟 压力：59.8bar序号容量瓶重g时间 (s)瓶重+水重g水重(g温度(密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均流量ml/min：RSD% 签名/日期: 复核
19、/日期:流量准确性测试结果-3 流量： 2.000ml/分钟 压力： 118.5bar序号容量瓶重g时间 (s)瓶重+水重g水重(g温度(密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均流量ml/min：RSD% 签名/日期: 复核/日期:流量准确性测试结果-4 流量： 3.00ml/分钟 压力： 179.1bar序号容量瓶重g时间 (s)瓶重+水重g水重(g温度(密度(g/ml)体积(ml)测得流量(ml/min)12345678910平均流量ml/min：RSD% 签名/日期: 复核/日期:838进样器准确度与穿插污染测试手动进样器A进样器准确度原理进样器准确
20、度的测试是利用注入屡次一样体积咖啡因标准品的方法进展。在一样注入体积下，色谱图应该显示一样面积的波峰，这些面积和平均面积的偏差应该愈小愈好，此偏差通常以面积标准差来表示，标准差与平均面积之比可得相对标准差。相对标准差即可用以作为准确度的测量，此数值最后再与可承受的标准围比较。B 穿插污染测试原理为测试样品穿插污染的情况，首先注入一高浓度的样品，将充满于另一样品瓶中的溶剂注入溶剂与前次高浓度溶液一样。在理想的情形下，第二次注射分析结果不应有样品出现，而第二次注射所出现的样品面积即可作为穿插污染的测定值指标。设备HP1100系列单元泵，手动进样器，配置有Chemstation控制的VWD检测器。测
21、试条件方法：HP OQ/PV之进样器准确度与穿插污染测试顺序位置样品名针数浓 度进样量图谱编号6空白30.0020ulOQPVINUPRC 014咖啡因4625ug/ml20ulOQPVINUPRC 046空白10.0020ulOQPVINUPRC 10。检测波长273nm. 管线A：纯水. 流量1.0ml/min . 限流毛细管2M*0.12mm i.d. 柱温箱温度：40。. 标准品*4(25ug/ml 咖啡因)，放在手动进样器旁边位置4。. HPLC级纯水空白瓶，放在手动进样器旁边位置6。测试评估每一个咖啡因波峰的面积、高度及停滞时间得到后，计算每一个波峰对平均值的相对标准差RSD%。认
22、可标准及结果进样器准确度与穿插污染认可标准测 试 项 目承受标准限制测 试 结 果结 论进样器准确度与穿插污染准确度 面积 RSD %1.000准确度 高度 RSD %2.0穿插污染 面积 RSD %0.2穿插污染 高度 RSD %0.4 签名/日期： 复核/日期： 进样器穿插污染测试结果 名 称 前次运行 当次运行 穿插污染% 峰面积 峰高 签名/日期： 复核/日期： 进样器准确度测试结果运行序号保存时间min峰高mAU峰面积mAU*S)456789平均：SDRSD95% CI签名/日期： 复核/日期：九、验证结果及结论91验证标准及结果测 试 项 目承受标准限制测 试 结 果结 论1VWD
23、波长准确性最大波长1准确度nm2.0最大波长2 准确度nm2.0最小波长准确度nm2.02.氧化钬波长波长准确性nm2.03.温度准确性左侧温度准确性边 2.0右侧温度准确性 2.04.检测器线性相关性0.999005. 杂讯, 温度准确性ASTM 杂讯mAU0.040偏移mAU0.2漂移mAU/h0.5温度稳定性左 0.5温度稳定性右 0.56.流量准确性/准确性准确性%5.0准确性%0.507.进样器准确度与穿插污染准确度 面积 RSD %1.000准确度 高度 RSD %2.0穿插污染 面积 RSD %0.2穿插污染 高度 RSD %0.4 填表人/日期：92结论 附录：分析所用方程式回
24、归分析杂讯测试及测试线性时均使用回归分析进展评估，通常回归分析的方程式表示如下，线性则由线性方程式得来：线性方程式：Y*=a+b*其中 N=观察值数目 *i=自变数，第i个观察值 Yi=因变数，第i个观察值方程式1 系数计算回归系数其中其中其中方程式2 相对标准差RSD的计算 标准差： 相对标准差：杂讯测试方程式3 以线性回归分析求取每个值的偏移 其中： Y*=讯号之应答 * =讯号时间a = 斜率，与偏移相等b = 偏称线之截距方程式4 波峰到波峰杂讯及偏离的求取NptoP=(RspMa*i-Yi)-(RspMinj-Yj )其中 Nptop = 波峰到波峰的杂讯PspMa*i =相对偏移有最大正垂直距离波峰i的应答 RspMini =相对偏移有小最负垂直距离波峰i的应答 y i=波峰i, 其偏移线的相对应应答yj=波峰j ,其偏移线的相对应应答方程式5 ASTM杂讯NASTM的计算 其中NPtopi =第i行循环之波峰到波峰杂讯n=总循环之总数检测器线性测试检测器线性是借助前面所提线性回归分析的相对标准差来表示。 与SD相等 其中 i=第i个咖啡因波峰之面积，高度中停滞时间。Aav n个实验咖啡因波峰之面积、高度或停滞时间的平均值。
