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1、ICSCCS甘肃 省DB地方标准DB/X草类植物香豆素含量测定Determinationofcoumarincontentinherbageplant（征求意见稿）（本稿完成日期：2022-05-06）-实施-XX-XX发布甘肃省市场监督管理局发布目次前言III1范围12规范性引用文件13术语和定义11.1 1香豆素coumarin14原理11.2 1色谱法11.3 荧光光谱法11.4 紫外光谱法11.5 近红外光谱法21.6 电化学传感法25试剂或材料25.1 甲醇25.2 乙醇25.3 标准品溶液25.4 标准品储备液25.5 微孔滤膜25.6 乙醇/水溶液25.7 四丁基四氟硼酸铁25.
2、8 N,N-二甲基甲酰胺25.9 电解质溶液26仪器设备26.1 高效液相色谱仪36.2 分析天平36.3 旋转蒸发仪36.4 振荡器36.5 超声波清洗器36.6稳态/瞬态荧光光谱仪36.7紫外分光光度计36.8 近红外光谱仪36.9 电化学工作站36.10三电极37试样制备与保存38分析步骤38.1提取38.2标准曲线的制备39测定49.1色谱法测定49.2荧光光谱法测定59.3紫外光谱法测定59.4近红外光谱法测定59.5电化学传感法测定510试验数据处理511精密度6附录A（资料型附录）香豆素标准样品色谱图7附录B（资料性附录）香豆素标准样品荧光光谱图8附录C（资料性附录）不同样品香豆
3、素近红外图谱9附录D（资料性附录）香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图（DPV）10,X,A刖百本文件按照GB/T1.12020给出的规则起草。本文件由廿肃省林业和草原局提出并监督实施。本文件由甘肃省草业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：兰州大学草地农业科技学院、中国科学院兰州化学物理研究所、农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）、兰州市农业科技研究推广中心。本文件主要起草人：张吉宇、董树清、王艺蒙、彭文静、闫启、王彦荣、邵士俊、王朋磊、张正社。草类植物香豆素含量测定1范围本文件规定草类植物中香豆素含量的色谱、光谱、电化学测定方法。本文件适用于草类植物中香豆素含量的测定和定量分析
4、。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版木（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1香豆素coumarin2H-1-苯并毗喃-2-酮，分子式为C9H6O2,相对分子质量146.13,呈白色结晶固体，具有抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗凝血等作用，可提高植物的抗逆性。4原理4.1 色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液
5、等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。长期以来作为最常见的主流分析方法。用80%乙醇提取草类植物样品中的待测物质香豆素，用液相色谱法检测，外标法定量。4.2 荧光光谱法利用荧光激发光谱、发射光谱和三维荧光光谱，可以鉴定植物中含量高且荧光强度大的香豆素活性成分，可通过低浓度溶液荧光分析测定其含量。是强荧光物质测定最适用的方法。4.3 紫外光谱法利用香豆素在30060Onm光谱区的分子吸收来进行分析测定的方法，这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁。4.4 近红外光谱法利用香豆素中的化学键的泛频振动或转动对近红外光的吸收特性，以漫反射或
6、投射方式获得在近红外区的吸收光谱或投射光谱，建立香豆素近红外光谱模型，计算植物中香豆素的含量。4.5 电化学传感法香豆素进入电解槽，在电解液中发生氧化还原反应，并产生电流，在一定范围内，电流大小与香豆素浓度成正比。5试剂或材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯；水均为GB/T6682中规定的一级水。5.1甲醇CH3OH,CAS:65-56-1,色谱纯；光谱纯；分析纯。5.2 乙醇CzHsO,CAS号:64-175色谱纯；光谱纯；分析纯。5.3 标准品溶液香豆素，C9H6O2,CAS:91-64-5,纯度N98%。5.4 标准品储备液香豆素为干态标准品，准确称量标准香豆素0.0146g,用甲
7、醇定容至IOOmL的容量瓶中，并稀释1000倍至浓度为0.146gmL,超声处理IOmin后经0.45m滤膜过滤并作为标准品储备液备用，现配现用。5.5 微孔滤膜尼龙滤膜或性能相当者，孔径0.45m5.6 乙醇/水溶液800mL乙醇与200mL水超声混匀。5.7 四丁基四氟硼酸铁Ci6H36BF4N,CAS号：42942-5,纯度98%5.8 MN-二甲基甲酰胺C3H7NO,CAS号：68-12-2,纯度N98%。5.9 电解质溶液称取相应重量的四甲基四氟硼酸镂，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂配制成Imol/L的电解质。6.1 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（DAD）.6.2 分析天平精确度0
8、.0001g。6.3 旋转蒸发仪6.4 振荡器6.5 超声波清洗器6.6 稳态/瞬态荧光光谱仪发射波长范围：350800nm.6.7 紫外分光光度计波长范围：300600nm.6.8 近红外光谱仪波长范围：14002600nm。6.9 电化学工作站电压范围：48V,6.10 三电极玻碳电极、对电极、参比电极。7试样制备与保存按GB/T14699.1的规定采集牧草样品。将鲜草样品于常温通风干燥或自然哂干制成干草样品，用四分法缩至50g100g,经粉碎机粉碎，全部通过0.45mm孔径筛，常温储存备用.8分析步骤8.1 提取称取干草样品1g（精确到0.001g）试样于25mL离心管中，加入25mL8
9、0%乙醇溶液，振荡IOmin,常温下超声提取30min后过滤，共提取2次，合并滤液，滤液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并转移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45m微孔滤膜过滤。8.2 标准曲线的制备8.2.1 色谱法分别准确吸取标准品储备液0.5、1、2、4、6、8、IOmL于IOmL容量瓶中，加甲醇至刻度。准确吸取20L,在色谱条件下进样，以对照品峰面积（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。8. 2.2荧光光谱法分别准确吸取标准品储备液0.5、1、2、4、6、8、IomL于IomL容量瓶中，加甲醇至刻度。用甲醇稀释500倍后，设定激发波长（EX）为660nm
10、,采样间隔（Inc）为5nm,激发狭缝（EXSlit）为2nm；发射波长的（Em）范围取650-750nm,采样间隔（InC）为5nm,发射狭缝（EmSIit）为2nm；积分时间设置为（integrationtime）：0.2s,于SIC模式下进行二维荧光图谱测定，以荧光强度（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。9. 2.3紫外光谱法分别准确吸取标准品储备液0.5、1、2、4、6、8、IOmL于IOmL容量瓶中，加甲醇至刻度。用甲醇稀释500倍，在30080Onm紫外波长范围内直接进样，以吸光度（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。10. 2.4
11、近红外光谱法将粉碎的样品在仪器上进行多次扫描，收集每个样品光谱值。通过光谱值与经典分析方法测定值的对应关系，建立预测模型，以样品的近红外预测值（X）为横坐标，经典分析方法测定值（Y）为纵坐标，得线性回归方程。11. 2.5电化学传感法分别准确吸取标准品储备液0.5、1、2、4、6、8、IOmL于IOmL容量瓶中，加甲醇至刻度。采用三电极体系，称取适量的四丁基四氟硼酸锈作为溶质，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂制备1.0mol/L电解质；测量前，用氮气将溶液脱气5min。在5.0mL电解液中加入10.0L样品溶液。将玻碳电极在砂纸上打磨，将氧化铝（0.1m）和水混合后用于电极抛光，之后超声清洗并晾干
12、备用。在电解池中加入5mL的电解质溶液，在-2.0-0.0V电位范围内以LOmWs的扫速进行扫描，待曲线稳定后加入标准溶液，在上述条件下用差分脉冲伏安法（DPV）测定不同样品的氧化峰电流。每次扫描结束后，要重新超声清洗后再检测，这是为了保持电极的重现性和稳定性。以电流（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。9测定11.1 谱法测定11.1.1 效液相色谱参考条件色谱柱:C18（填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶），柱长250mm,柱内径4.6mm。流动相:A相为甲醇，B相为水，A:B为65:35。流速:1.0mL/min。检测波长:280nm。柱温:35。进样量:20L取样品溶
13、液上机分析，通过标准曲线作多点校准，用外标法定量测定。11.2 光光谱法测定11.2.1 光光谱法参考条件二维荧光光谱激发波长60Onm,发射波长672nm,狭缝4nm,步径2nm,样品量2mL。11.2.2 谱法定量测定待测样品按照8.1方法制备好样品溶液，使用荧光分光光度计进行测定，由8.2.2的标准曲线查得样品中香豆素的浓度。11.3 外光谱法测定11.3.1 外光谱法参考条件紫外波长范围：300800nm,样品量2mL。11.3.2 外光谱法定量测定待测样品按照8.1方法制备好样品溶液，使用紫外分光光度计进行测定，由8.2.3的标准曲线查得样品中香豆素的浓度。11.4 红外光谱法测定9
14、. 4.1近红外光谱法参考条件近红外光谱波长范围：14022600nm0样品量210g。9. 4.2近红外光谱法定量测定待测样品按照8.1的方法进行测定，由824的标准曲线查得样品中香豆素的浓度。12. 5电化学传感法测定1 .5.1电化学传感法参考条件起始电位：-2.0V,终止电位：0V,进样量5mL9 .5.2电化学传感法定量测定按照8.2.5的方法，在5.0mL电解液中加入10.0L样品溶液，用差分脉冲伏安法(DPV)测定不同样品的氧化峰电流。由标准曲线中查得样品中香豆素的浓度。10试验数据处理试样中待测物含量以质量分数裱示，单位为微克每克(gg),按公式计算。ClVinCV式中：Ci一
15、一试样溶液中香豆素浓度，由标准曲线中查得，单位为微克每亳升（gmL）;Vi一一提取液体积，单位为亳升（mL）;V提取液总体积，单位为亳升（mL）;一一稀释倍数；C试样的浓度，单位为克（g/mL）。测定结果用平行测定的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。11精密度在重复性条件下，获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%,以大于20%的情况不超过5%为前提。附录A（资料型附录）香豆素标准样品色谱图图A不同浓度香豆素标准品的色谱图附录B（资料性附录）香豆素标准样品荧光光谱图图B不同浓度香豆素标准品的荧光光谱图附录C（资料性附录）不同样品香豆素近红外图谱Swpte:IR
16、2: .86 SS 0.08RefvAje:Equat:y0.96 x+0.01NRyAjc:图C不同样品的香豆素近红外分析预测模型附录D(资料性附录)香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图(DPV)图D不同浓度香豆素标准品的差分脉冲伏安图(DPV)甘肃省地方标准草类植物香豆素含量测定技术标准的编制说明甘肃省地方标准草类植物香豆素含量测定技术标准的编制，经过长时间试验验证和多方位征求意见，以及数次修改补充完善，现已完成征求意见稿，提交委员会评审。一、工作简况1、编制标准的目的意义香豆素在植物中分布广泛，芸香科、豆科、伞形科等74科、330多个属的植物中发现了香豆素类化合物。香豆素及其衍生物广泛存在
17、于草类植物中,如草木樨、野牛草、车叶草等牧草中香豆素含量大，气味重，家畜摄入过多后会出现败血症等症状，直接降低了家畜的采食率，影响了牧草的适口性。而传统草本中药蛇床子、秦皮、白芷等含有丰富的香豆素，香豆素类化合物具有抗HIV、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多方面的生物学活性，已经作为中药质量控制的一类重要指标成分。因此草类植物中香豆素类化合物的分析检测具有重要意义。现有检测香豆素的标准仅限于食品添加剂、香水成分等，尚未见到植物中香豆素含量测定的相关标准。另外，色谱技术操作繁琐，需要训练有素的仪器操作人员，分析运行成本较高。荧光分析法具有高灵敏度、低检测限和操作简单等优势，可以直接对某些香豆素进行
18、定量分析。光电技术由于具有简便、快速、灵敏、适合现场和在线分析等优点，具有广泛的应用前景。基于此，制定“草类植物香豆素含量测定”标准能够快速有效的进行植物香豆素含量的测定，保障我省畜牧业和中药等生态产业发展的迫切需要，提质增效助力甘肃绿色发展。2、主要工作过程在2020年9月向甘肃省市场监督局提交了草类植物香豆素含量测定制修订项目建议书，兰州大学草地农业科技学院、中国科学院兰州化学物理研究所、兰州市农业科技研究推广中心立即启动标准制定工作，共同起草编写。（1）成立了标准起草修改小组。（2）查阅国内外草类植物香豆素测定方法及数据，为草类植物香豆素含量测定（草稿）的制定做好理论准备。（3）采用色谱
19、、光谱和电化学三种方法测定草类植物内香豆素的含量，完善标准方法，为后期标准制定及完善做准备。（4） 2020年9月完成草类植物香豆素含量测定（草稿），形成了草类植物香豆素含量测定（工作组讨论稿）。（5） 2021年12月，标准起草组组织召开标准研讨会，围绕草类植物香豆素含量测定标准文本和标准编制说明等材料进行了充分研讨，在此基础上形成了定向征求意见稿。3、征求意见情况标准起草组在完成征求意见稿后，于2022年1月组织定向征求部级质检机构、推广单位、企业、研究所、大学和基层农业单位的意见。征求单位包括农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）、甘肃省草原技术推广总站、亚盛集团农业研究
20、院、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、中国科学院兰州化学物理研究所、甘肃中医药大学、甘肃省武威市民勤县农业农村局共7个单位的修改意见，归纳合并基本相同的意见后共形成30条修改意见，采纳25项。2022年3月，在对收集到的征求意见归纳整理的基础上，认真修改了草类植物香豆素含量测定（征求意见稿），并再次请有关专家进行了修改完善,最终形成了草类植物香豆素含量测定（征求意见稿）。4、主要编制成员及所做工作张吉宇兰州大学草地农业科技学院教授，主持标准编制的全面工作，负责标准起草、人员调配协调及标准的修改等工作。董树清中国科学院兰州化学物理研究所研究员，负责标准中方法制定、标准各版本的修改、负责开展标准
21、初稿的撰写等工作。王艺蒙兰州大学草地农业科技学院硕士研究生，参与标准中方法的制定，负责标准编制过程中意见的归纳及整理，协助负责人开展标准初稿的撰写。彭文静兰州市农业科技研究推广中心，参与制定标准拟推广区域的样品采集和验证。闫启兰州大学草地农业科技学院博士研究生，负责标准编制过程中意见的归纳及整理，编制说明的撰写及修改等工作。王彦荣兰州大学草地农业科技学院教授，负责标准初稿、征求意见稿的审阅及修订等工作。邵士俊中国科学院兰州化学物理研究所研究员，负责标准初稿、征求意见稿的审阅及修订等工作。王朋磊兰州大学草地农业科技学院硕士研究生，参与标准中方法的制定，标准的资料收集和整理等工作。张正社兰州大学草
22、地农业科技学院师资博士后，标准的资料收集和整理、标准的修改等工作。二、标准所涉及的产品、适用范围的基本情况1、标准所涉及的产品草类植物香豆素含量测定地方标准涉及草类植物的草产品、种子等产品。2、 标准的适用范围草类植物香豆素含量测定标准适用于草类植物中香豆素含量的测定和定量分析。三、标准编制原则和技术资料1、本标准编制主要遵循以下原则：（1）、科学实用原则。标准内容上体现理论与实践的有机结合，在尊重科学、实践验证、广泛征求意见及调查研究的基础上，做到方法科学合理，结果准确可靠，可操作性和实用性强。（2）、与现行有关法律、法规和相关标准协调的原则。本标准是草类植物中香豆素含量测定的重要技术依据。
23、对涉及我国现行有关法律、法规和相关的强制性标准内容，本标准均适用。（3）、可持续发展原则。通过检测技术和质量的标准化，使草类植物的香豆素含量的测定更加准确、快速，为加快优质草产品市场培育提供技术支撑，更好地服务国内外市场需求，达到效益的最大化，加速草牧业规模化、优质化和产业化的形成，从而能促使草畜产业健康持续发展。2、主要参考标准及技术资料:本标准的确定，参照国家标准，适宜我省境内实施应用。主要参考依据有化妆品中香豆素及其衍生物的测定高效液相色谱法（GBT357982018）食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定、“低香豆素草木樨遗传选育、种子扩繁及转录组研究”、“Coumarin
24、content,morphologicalvariation,andmolecularphylogeneticsofMeIiIotUs、“草木樨香豆素快速精准检测的方法和应用研究”等标准和科研论文。四、本标准有关技术的说明本标准的主要技术内容及结构包括：1、范围：本标准规定了利用高效液相色谱法、光谱法（荧光、紫外、近红外）、电化学法对白花草木樨QMeliIOtUSalbus）、黄花草木樨QMelilotusOffiCinalis）、细齿草木樨（MelilotUSdematUS）等草类植物香豆素含量的检测方法。规范性引用文件，术语和定义，原理，器具及试剂。本标准适用于以上草类植物香豆素含量的测定
25、。2、不同测定方法选择及应用：本标准中高效液相色谱法、光谱法（荧光、紫外、近红外）、电化学法对草类植物香豆素含量的检测方法，可根据实验室仪器设备条件、试验方法等选择和应用。在结果计算和表示是应注明具体方法。3、检验程序：利用高效液相色谱法、光谱法（荧光、紫外、近红外）、电化学法对草类植物香豆素含量的检测方法。4、结果计算和表示。五、实施标准建议和措施1、举办培训班根据培训对象和目的不同等，举办多种形式的培训班，例如初级培训班、高级研讨班、专题培训班，区域性培训班等。以提高香豆素检测工作的整体水平和促进其标准化的进程。2、制订实施细则各检测中心（站）可根据检测条件和检验员水平编制适合本中心（站）
26、情况的实施细则，以便于工作中应用。3、开展评价技术的协作研究建议草品质科技人员积极开展检验技术的协作攻关研究。尤其是牧草香豆素鉴定和测定新技术的研究。协作中，有组织、有目的、有选择、有分工地跟踪国际、国内牧草香豆素测定新技术的发展动态，并结合我省的特点开展工作，为畜牧业的发展贡献力量。4、加大宣传推广相关职能部门组织动员本行业技术推广单位、企业及草牧业生产者对本技术的应用，为加快草牧业发展早日发挥效益。六、与现行法律、法规、国家相关标准和产业政策的一致性说明本标准的制定严格遵守我国现行的法律、法规、国家相关标准和产业政策的要求。目前我国还没有国家及行业的有关草类植物香豆素测定技术的标准。畜牧业
27、是甘肃的传统优势产业，制定针对优质牧草相关标准意义重大。本标准的制定与现行法律、法规及国家相关标准没有冲突，完全符合地方产业发展的政策要求。七、重大分歧意见的处理和依据本标准在编写过程中没有重大分歧。八、作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议建议本标准作为推荐性地方标准使用。九、贯彻地方标准的要求和措施建议本标准制定目标是满足牧草生产和检验工作的实际需要，为满足畜牧业对优质牧草的需求提供依据。目前国内尚无同样及类似的技术标准，本标准通过后将做好大力推广和宣传工作，尤其是加大本行业技术推广单位、企业及草牧业生产者对本技术的应用。十、预期的社会、经济和生态效益草类植物香豆素含量测定标准的制定和颁布，不仅可满足牧草生产和检验工作的实际需要，而且可弥补该项检验方法的空白，也将为国家标准的制定奠定技术基础。本标准的实施，为满足畜牧业对优质牧草的需求提供依据，对草牧业的发展、食品安全以及草产业的持续健康发展具有可操作性现实意义，并将产生巨大的经济效益。甘肃省地方标准草类植物香豆素含量测定标准起草小组二O二二年五月六日
