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1、ACTH预防和治疗肾移植受者高脂血症及改善肾功能的机制探讨课题申请报告(-)立项依据与探讨内容1.项目的立项依据1.1探讨意义文献报道，肾移植后高脂血症的发生率可高达60-70%,显著高于正常人群。无论是传统的免疫抑制剂还是最近应用于临床的新型免疫抑制剂均可引起高脂血症，环泡素A(CSA)、类固静激素导致血脂上升的作用较强,FK用6、雷帕霉素、硫哩嚓吟的作用较弱lf2,3o王玉新等认为HK506对甘油三酯代谢的影响较显著，CsA对胆固醇及富含胆固醇的脂蛋白代谢的影响较明显，泼尼松对两者均有显著的影响。高脂血症对于肾移植患者的长期存活和生活质量有重要影响，可以导致慢性移植肾肾病，是造成移植肾失功
2、的重要缘由之一。慢性移植肾肾病病因困难，包括同种抗原依靠性因素和非同种抗原依养性因素，目前高脂血症作为非同种抗原依靠性因素之一已成为慢性移植肾肾病发病机制探讨的热点之一。1982年MOOrhead首先提出高脂血症是肾小球硬化的独立危急因素，近年来大量证据表明高脂血症在肾脏疾病的发生发展中起重要作用。在慢性移植肾失功的动物模型中高胆固醇血症发生率极高。越来越多的临床探讨也证明高总胆固静(Totalcholesterol,TO血症与高甘油三酯(TriglyceridelTG)血症是慢性移植肾失功的危急因素ODimny等发觉,慢性移植肾失功组患者血TC和TG水平显著上升:且移植前及术后6月时的血TC
3、、TG水平与血管内膜增生、间质纤维化等移植肾慢性损伤病理积分正相关。高TC、高TG血症的肾移植受者急性排斥发生率高，早期肾功能复原差。在151例移植,患者中，术前和术后6月时血TG水平高的患者，术后两年慢性移植肾失功发生率显著上升5.WiSSing等探讨证明，高TG血症、高TC血症是慢性移植肾失功的独立危急因素：同时发觉移植后第一年无急性排斥反应的病人在随后10年内高胆固静血症对移植肾丢失无影响，而高胆固醇血症对于移植后第一年经验了急性排斥反应事务的病人的移植肾丢失却有显著的影响6另一个多因素分析探讨认为，在肾移植前后，高甘油三酯血症和脂蛋白a30mgdl是慢性移植物失功的两个独立危急因子7。
4、2000年荷兰鹿特丹的一个探讨显示血清胆固醉水平是病人、移植物存活的一个独立危急因素，这种影响是非线性的。在年青受者中血清胆固醇的风险最大，低肌酊水平的病人移植物功能衰竭率与胆固醇的相关性最高8。牛津移植中心发觉血清甘油三酯水平与慢性移植肾失功关系最亲密，移植后一年高甘油三酯血症(2.711三11.)是慢性移植肾功能衰竭的危急因子之一(0R=3.06,95%CI:1.595.90,PO.OOOD9。目前倍受重视的是，在慢性移植肾肾病的发展过程中，高脂血症与其它因素具有协同促进作用，如高血压、移植术后糖尿病(PlDM)、触耐量异样、胰岛素反抗、高胰岛素血症、纤维蛋白溶解障碍及PAl-I活性增加等
5、。新型的免疫抑制剂提高了肾移植的近期存活率，但未能明显改善移植肾的长期存活率。因此，全美胆固醉教化支配建议全部肾移植患者应当接受血浆脂质水平的监测，同时应用降脂药物，无论病人有无高脂血症10O临床上主要的降脂治疗方案包括(1)饮食治疗，主要是指进食低脂肪、低饱和脂肪酸和低胆固醉食物，但其效果并不志向，多数患者仍须药物干预。(2)调整免疫抑制剂，如将CSA切换成FK-506,但其准确疗效及其平安性尚有待于进一步证明。(3)运用降脂药物，首选的降胆固醉药物以他汀类药物效果最好，但他汀类药物在调脂治疗的临床实践中仍有一些局限性，它对部分患者无效，而且他汀类药物与免疫抑制剂同时运用，可出现肌炎、横纹肌
6、溶解等毒副作用，并影响CSA的汲取，而且，降低TC和低密度脂蛋白胆固醉(1.oW-density1ipoproteinscholesterol,I.D1.-C)的达标率有限。因此对肾移植患者的高脂血症有必要开展新的高效、毒副作用小的治疗方法。促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotrophichormone,ACTII)是垂体前叶分泌的一种激素，是39个氨基酸组成的单链多肽，分子量4500道尔顿。不同种属动物ACTH氨基酸组成略有差异。AeTH的活性部位为第410位的7肽片段，国外一股应用人工合成的第124位的活性肽(ACTHl-24,SynacthenDepot;CIBA-GeigyA
7、G,Basel,SWiIZerIand)OACTH具有调整糖皮质激素分泌的功能，并且在神经内泌网络中具有肯定的作用。探讨表明ACTH具有明显的降脂作用；同时，本课题组的预试验证明ACTH还能改善肾移植受者的肾功能。本项目将应用ACTH4-10及ACTH1-24分别对高脂饮食的新西兰兔及慢性移植肾失功和/或高脂血症的肾移植受者进行探讨，以探究ACTH治疗肾移植受者高脂血症及改善肾功能的机制。1.2国内外探讨现状及分析1.2.1ACTH调整脂质代谢的作用机制及动物模型的选择多项探讨表明，短期应用ACTH1-24能明显降低正常志愿者、慢性肾病病人及原发性高脂血症病人的TC和1.D1.-C,降幅最高可
8、分别达43%和56%,长期应用能明显削减血清TG水平，同时，血清载脂蛋白B(ApolipoproteinB,apoB)下降10-47%11-16o探讨还发觉AcrH不但能够降低1.D1.-C水平，而且还能上升具有爱护作用的HD1.-C的浓度UIT4。ACTH也能明显降低1.P（八）(公认的致动脉粥样硬化的脂蛋白)水平，降幅最高可达66%11,12,16,17目前对于ACTH降低血脂的机制并不非常清晰。在培育的肾上腺皮质细胞以及人的肾上腺组织中，ACTH能上调1.D1.及HD1.受体18,19,还可增加胚胎肾上腺组织中1.D1.的结合位点20在HepG2细胞中，ACTH可增加同位素标记的受体特异
9、性1.D1.颗粒的摄取和降解15,还可选择性地下调HepG2细胞apoBmRNA的表达及apoB的分泌，并且呈剂量依靠效应21。然而，有些探讨却认为，ACTH并不能促进肝脏1.D1.受体和清道夫受体BI(ScavengerreceptorBI,SR-BDmRNA的表达22-24此外，ACTH在脂质和脂蛋白代谢方面的作用存在种属差异。探讨表明大鼠及小鼠在ACTH长期作用后，可导致血浆胆固醇上升25,我们也发觉了这种现象26这再次提示了ACTH降脂机制的困难性。因此，要进一步探讨ACTH改善高脂血症患者血脂代谢的机制，首先必需建立一种经ACTH治疗后，其脂代谢变更与人相像的动物模型。本课题组的预试
10、验结果显示，高脂饮食的新西兰兔经ACTH1-24治疗后，其脂代谢变更趋势与人类相像，可以作为进一步探讨ACTH降脂效应的试验动物模型(BiochimicaetBiophysicaActa,修稿中)。1.2.2ACTH调整肾移植受者血脂代谢及改善肾功能的效应和平安性国外探讨表明ACTH能够明显改善血脂代谢，在对健康个体、肾病患者、原发性高脂血症患者的临床试验中都取得了满足的疗效27-29:同时也能够明显提高特发性膜性肾病患者的肾小球滤过率，降低尿蛋白，未发觉有明显的毒副作用30o本探讨组视察了ACTH短期治疗对肾移植受者高脂血症的效果和平安性,将30例肾移植术后高血脂患者随机分为ACTH治疗组(
11、n=15)和比照组(n=15)比照组不赐予任何降脂治疗，治疗组接受连续5天的AeTH治疗(25U/天)，分别检测并比较两组血脂变更。结果发觉治疗组的15例患者血脂水平均有不同程度的改善，其中TC、TG、1.P（八）、1.D1.、apoB均明显降低，分别削减了12%(P0.01),22%(P0.01),29%(P0.01),17%(P0.05)和11%(PO.ODo而HD1.和apoAl则平均增加了10%(P0.05)和9%(P0.05)。1.D1./HD1.有显著降低,削减26%(P0.05)。apoI/apoB则显著上升，增加31%(PO.05)o肝功、生化保持正常，血CSA浓度保持平稳。无
12、明显副作用。而比照组前后两次血脂水平无显著性变更31O此后又随机选取6例肾移植术后慢性移植肾功能不全患者，视察了ACTH1-24阶段治疗对肾移植受者脂质代谢及肾功能的疗效和平安性。患者第一周赐予连续4天的ACTHl-24肌注治疗（Img/day）,结果显示5例患者肾功能改善，1例患者血肌酎上升；血清apoB水平明显下降,而HD1.Y则显著上升320全部6名受试者其次周起接着肌注ACTH1-24,每周一次（Img/次），持续10周，治疗结束后，6名患者肾功能都有明显改善。表现为血肌肝水平下降，肾小球滤过率增加（图1）。血脂水平的变更趋势同短期治疗结果（待发表）。图1.ACTH1-24治疗前后肾移
13、植受者肌醉及肾小球滤过率比较参考文献（黑体字标出的作者为本课题负责人或主要参与者）1.QuaschningT,MalnkaT,NauckM,etal.ImnlUnOSUPPreSSionenhancesatherogenicityof1.iPidprofileaftertransplantation.KidneyInt,1999,56（sup71）：235-2372.BanasikM,KlingerM.Chronicallograftnephropathy-immunologicandnonimmunologicfactors.AnnTransplant.2006;11（1）:7-103.Ka
14、nbayM,YildirirA,AkcayA,etal.Effectsofimmunosuppressivedrugsonserumlipidlevelsinrenaltransplantrecipients.TransplantProc.2006Mar;31.cholesterolconcentrationsinhemodialysispatients.KidneyInt.1997Dec;52（6）:1651-5.30.BergA1.,NiIsson-EhleP,ArnadottirM.BeneficialeffectsofCTHontheserum1ipoproteinprofiIeand
15、glomerularfunctioninpatientswithmembranousnephropathy.KidneyInt.1999Oct:56（4）:1534-43.31.曹贽杰，何小舟,NingXu.ACTH短期治疗肾移植术后高脂血症.好用临床医学.2004:5(1):10-12.32.HeX,XueP,XuX,1.uoG,ZhouG,NiIsson-EhleP,XuN.Short-termAdministrationofACTUImprovesPlasma1.ipidProfileandRenalFunctioninKidneyTransplantPatients.Transplan
16、tProc.2006;38(5):1371-1374.2.项目的探讨内容、探讨目标以及拟解决的关键问题2.1探讨内容2.1.1探讨表明在肾病患者中长期运用ACTH1-24能明显改善肾小球功能，使尿蛋白削减，肾小球滤过率增加。本探讨小组在试验中也发觉ACTH1-24能改善肾移植患者的肾功能。但对其改善肾功能的机制并不清晰，揣测可能与血脂下降有关，因此本探讨选择慢性移植肾失功和/或高脂血症的患者，在ACTH1-24治疗前后进行移植肾活检，探讨ACTH1-24对移植肾组织学的影响,并检测TGF-kPDGF、-IFN等细胞因子，进一步探讨ACTH1-24改善肾功能的病理生理机制。2.1.2本课题组的前
17、期探讨表明高脂饮食的新西兰兔经ACTH1-24治疗后，其脂代谢变更趋势与人类相像，可以将其作为进一步探讨ACTH降脂效应的试验动物。在此基础上我们将应用ACTH4-10对高脂饮食的新西兰兔进行相关的治疗探讨。因为ACTH4-10与ACTH1-24相比，具有明显的优势,前者不仅能与ACTH受体结合，发挥生理作用，而且不刺激皮质激素释放：同时由于其仅由7个第基酸组成，可以经粘膜给药。2.2探讨目标2.2.1明确ACTH4-10对高脂饮食的新西兰兔的降脂效应。2.2.2进一步明确ACTH1-24改善肾移者受者脂代谢失调的治疗效应及可能的机制。2.2.3探讨ACTH1-24改善肾功能的病理生理机制。2
18、.3拟解决的关键问题2.3.1志愿受试者的动员。2.3.2移植肾活检的实施3.拟实行的探讨方案及可行性分析3.1技术路途以下技术路途中所涉及的ACTH的用法为：动物，100gkgd,连用5天：人，lmgd,连用4天后，每周一次，疗程12周。慢性移植肾失功和/或高脂血症的肾移植受者基本明确ACTH预防和治疗肾移植受者高脂血症及改善肾功能的机制ACTH1-24治疗前后肾活检组织人体试验ACTH1-24治疗前一次及治疗后每周一次收集血液标本ACTH1-24治疗前一次及治疗后每周一次收集留取24小时尿液标本常规检测血脂、肾功能、肝功能及血环抱素A浓度等指标；检测尿微量蛋白、尿肌酎、IgM及皮质醉等指标
19、免疫组化检测TGFT、-IFN.PDGF.HNF等因子电镜视察用ACTH4-10注射新西兰兔、设立生理盐水注射比照组动物试验取动物肝脏、肾上腺等石腊包埋组织ACTH4-10治前后收集兔血检测血脂指标，包括ChoMG.HD1.-C、1.D1.-CapoA1.apoB、1.p（八）等液氮保存组织免疫组化检测TGFT、-IFN、PDGF、HNF等因子RealtimeRTPCR检测相关指标的表达状况3.2可行性分析ACTH作为抗炎症制剂，在临床上常用来治疗一些难治性疾病，如炎症性肠病、儿童肾病综合征和多发性硬化等。随着对ACTH免疫生物学活性的深化了解，现在认为ACTH至少通过以下两种途径发挥效应：通
20、过内源性皮质激素的分泌，间接引起免疫抑制：借助免疫细胞膜上的特异性结合受体，干脆影响免疫功能。故AeTH应用于肾移植受者，不仅可以发挥其调整血脂的作用，同时ACTH可以脉冲式刺激肾上腺，使其分泌内源性皮质激素，发挥其间接免疫抑制作用。所以本课题的探讨在理论上是可以实现的。另外本课本应用(CTH1-24,SynacthenDepot;CIBA-GeigyAG,Basel,Switzerland)作系列探讨，避开了动物(牛、羊、猪等)源性ACTH长期运用而引起的人体反抗。AcTH1-24作为处方药在欧美等国家已运用了多年，其平安性值得信任，这有利于本课题的顺当实施。本单位已从事ACTH探讨近四年，
21、具备肯定的探讨基础。分子生物学试验室已具备开展本项探讨的仪器设备。在血脂、蛋白分析以及核酸检测等方面有丰富的阅历。本院为三级甲等综合性医院，医院为获得资助的课题进行1:1的配套投入。本课题组成员有高级职称4人,中级职称4人,初级职称1人；皆有肯定科研阅历，人才队伍支配合理，信任本课题定能如期完成。4 .本项I=I的特色与创新之处以往对ACTH降脂作用的探讨大多局限于对其降脂效应的视察，对其降脂的机理探讨不多，本项目将建立对ACTH生理学反应与人相像的高脂血症动物模型，着重探讨ACTlI1-24改善脂质代谢的机理。同时本探讨将用ACTH1-24治疗肾移植术后慢性移植肾失功和/或高脂血症患者，在以
22、往的工作基础上，通过对移植肾组织病理学的视察以及对TGF-1.PDGF.-IFN等细胞因子的监测,达到阐明ACTH1-24改善肾功能的病理生理机制的目的。5 .年度探讨支配及预期探讨结果2008.1-2008.8探讨ACTH4-10对高脂饮食的新西兰兔的降脂效应。本阶段撰写相关论文1篇。2008.9-2009.6开展ACTH1-24治疗作用的相关探讨，并完成各类预定指标的检测。本阶段撰写相关论文12篇。6 010.7-2010.8完成ACTH1-24在人体上的试验。本阶段撰写相关论文12篇。7 010.9201012总结资料，进行课题鉴定，并且进一步深化该课题的探讨。（一）探讨基础与工作条件1
23、.工作基础本课题担当单位己胜利进行肾移植1300多例,每年可完成肾移植80-100例。开展ACTH预防和治疗肾移植受者高脂血症的探讨已近四年，前期探讨表明：应用ACTH短期治疗能明显改善肾移植受者的脂质代谢，并能部分改善肾移植受者肾功能（HeX,etal.TransplantProc.2006:38（5）:1371-1374.）本课题组成员瑞典隆德高校PeteriIsson-Ehle教授从事ACTH调整脂质代谢的探讨将近30年。他在ACTH的探讨领域内积累了丰富的阅历。本课题组成员在AcTH探讨领域内已发表相关文章14篇，其中11篇被SCl收录。2.工作条件已具备全部试验条件，仪器设备列表如下
24、：（1）1.ightcycler荧光定量核酸检测仪（2）BIO-RAD公司凝胶成像分析系统（3）eppendorf高速冷冻离心机（4成PPendOrf系列加样器（5）Eppendorf控温混匀器（6）美国产超纯水处理系统（7）日本产C02培育箱（8）日本产超低温冰箱（9）半自动的标仪一台（10）磁性酶联分析仪（11）美国产电子天平（12）无菌操作台二台（13）国产离心机数台（14）液氮罐、电热恒温鼓风干燥箱（15）722分光光度计（16）奥林巴斯生物倒置显微镜（17）BTO-RAD公司垂直电泳槽及垂直电泳仪（18）国产转移电泳槽及转移电泳仪、水平电泳仪（19）组织匀浆机（20）冰冻切片机（21
25、）动物房及动物手术室3.申请人简历（三）经费申请说明经费预算及其简要说明经费预算（单位：万元)科目预算金额(括号内为申请经费)简要说明一、探讨经班50(25)1.科研业务贽12(6)(1)测试/计算/分析费(2)能源/动力费2(1)水电费(3)会议费/差旅费4(2)用于参与相关探讨的学术会议费及差旅费(4)出版物/文献/信息传播事务费6(3)文章版面费、文献检索费及科研成果发布费2.试验材料费(1)原材料/试剂/药品购置费38(19)用于购置ACTH、试验动物及相关检测试剂(2)其他3.仪器设备费(1)购置试制4.试验室改装费5.协作班6其他二、国际合作与沟通费8(4)1.项目组成员出国合作沟通2.境外专家来华合作沟通8(4)用于NilSSOn-EhIe教授回国指导课题的部分机票班三、劳务费四、管理费2(1)科研管理及组织鉴定费五、其他经费总预算申请经班30其他经费来源(单位：万元)自然科学基金其他项目资助经费国家其他支配资助经费其他经费资助(含部门匹配)30合合计60
