高效液相色谱法HPLC的概述.doc

《高效液相色谱法HPLC的概述.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法HPLC的概述.doc（24页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。

1、此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（113楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析

2、速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在中国药典中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和

3、反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。 2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，

4、气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量X围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。

5、然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8柱）、氨基或氰基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。常用流动相有甲醇水或乙腈水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。 （四）检测器 在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器（UVD），可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检

6、测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。高效液相色谱基础知识介绍（113楼）一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 色谱图（chromatogram）-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. 基线（base line）-流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音（noise）基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或

7、色谱柱被污染所致。 漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰（peak）-组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 拖尾因子（tailing factor,T）-T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）中国药

8、典规定T应为0.951.05。T1.05为拖尾峰。 峰底基线上峰的起点至终点的距离。 峰高（Peak height,h）峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width,W）-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4。 半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）-峰高一半处的峰宽。W h/22.355。 标准偏差（standard deviation, ）-正态分布曲线x=1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、

9、柱效低。 峰面积（peak area,A）峰与峰底所包围的面积。A=h2.507h=1.064Wh/2h Last edit by madprodigy2.定性参数（保留值） 死时间（dead time,t0）-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积（dead volume,V0）由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应

10、尽量减小。V0Ft0（F为流速） 保留时间（retention time,tR）-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积（retention volume,VR）-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRF*tR . 调整保留时间（adjusted retention time,tR）-扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因此，tR(或tR)可用于定性。TR=tR-t0 调整保留体积（adjusted retention vo

11、lume,VR）-扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR 3.柱效参数 理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N=（tR/）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W：峰宽 ； ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一X多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐

12、加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。） 若用调整保留时间（tR）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR/W)2 理论塔板高度（theortical plate height,H）每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N 4.相平衡参数（distribution coefficient,K）-在一定温度下，

13、化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=xs/xm Cs-溶质在固定相中的浓度 Cm溶剂在流动相中的浓度 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs 、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰；而

14、有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 容量因子（capacity factor,K）-化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比

15、。K（tR-t0）/t0=tR/t0（或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量）。因此，容量因子也称质量分配系数。 K=Cs/Cm=KVm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积； Vm：色谱柱中流动相的体积。 分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k=K=,tR=kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组份在固定相中停留的时间（tR）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR=0;k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固

16、定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。 选择性因子（selectivity factor,）-相邻两组份的分配系数或容量因子之比。（设k2k1）。因k=tR/t0,则k2/k1，所以又称为相对保留时间（美国药典）。 要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5.分离参数 分离度（resolution,R）-相邻两峰的保

17、留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=（tR2-tR1）/(W1+W2)/2,当W1=W2时，R=。当R=1时，称为4分离，两峰基本分离，裸露锋面积为95.4，内测峰基重叠约2。R=1.5时，称为6分离，裸露锋面积为99.7。R1.5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。 基本分离方程分离度与三个色谱基本参数有如下关系： R=1/4（-1）N0.5k/(1+k) 其中N称为柱效项，为柱选择项，k为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。 从基本分离方常可看出，提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保

18、留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及PH值；b.改变柱温；c.改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2 在110X围内，最好为25，窄径柱可更小些。二、塔板理论1.塔板理论的基本假设 塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在

19、色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为： 1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。 2）样品加在第0号塔 板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔 板体积。 4）在所有塔 板上分配系数相等，与组分的量无关。 虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。 2.色谱流出

20、曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A） 根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述； C=e 或 C=e 由色谱流出曲线方程可知；当t=tR时，浓度C有极大值，Cmax=.Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明；当实验条件一定时（即一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。 当进样量一定时，越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。 由曲线方程对V（0）求积分，即得出色谱峰面积ACmax =C0。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/22.355代入上式，即得A1.064Wh/2h，此为正常峰

21、的峰面积计算公式。三、速率理论（又称随机模型理论） 1.液相色谱速率方程 1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板理论高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。 后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）： H2dp+sup5(2p+sup 5(2p+sup 5(2f 2.影响柱效的因素 1)涡流扩散（

22、eddy diffusion）.由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2dp,dp为填料直径，为填充不规则因子，填充越不均匀越大。HPLC常用填料粒度一般为310 um，最好35um，粒度分布RSD5。但粒度太小难于填充均匀（大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，越小。总的说来，应采用而均匀的载体，这种有助于提高柱效。毛细管无填料，A=0。 2）分子扩散（molecular diffusion）.又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2rDm/u.u为流

23、动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm 很小，通常仅为气相的10-410-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。r一般在0.60.7左右，毛细管柱的r1。 3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。 流动相传质阻抗HmCmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于

24、在一个流路中硫路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相迁移，因而产生峰展宽。 静态流动相传质阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。 Hsm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低力度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大

25、Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。 固定相传质阻抗HsCsd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df 的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：进样时间要短。填料粒度要小。改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度

26、uopt,在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.030.1mm/s）在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。较小的检测器死体积。 Last edit by madprodigy3.柱外效应、 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和， 即：22柱内+2柱外+2器它 柱外效应主要有低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对

27、接宜成流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积VR/2。 柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k5MM；实验室制备柱，内径2040MM，柱长1030CM；生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。2.柱的发展方向 因强调分析速度而发展出短柱，柱长310CM，填料粒径23UM。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2MM的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优

28、点是：节省流动相；灵敏度增加；样品量少；能使用长柱达到高分离度；容易控制柱温；易于实现LCMS联用。 但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1100UL/MIHN的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。 3.柱的填充和性能评价 色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度20um 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒20um时，湿法填充较为理想。填充方法一

29、般有四种：高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；径向加压法，Waters 专利；轴向加压法，主要用于装填大直径柱；干法。柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。 必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。 无论是自己装填的还是购买的色谱柱,使用前都应对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要生意重新检查.柱性能指标包括在一定实验条件下(样品,流动相,流速,温度)下的柱压,理论塔板高度和塔板数,对称因子,容量因子和选择性因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复

30、性在或以骨。进行柱效比较时，不要注意柱外效应是不有变化。 一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长，内径，填料的种类，粒度，色谱柱的柱效，不对称度和柱压降等。在操作中注意的地方1、流动相的抽作要求： 高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法） 2、吸滤头： 特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。 3、单向阀： 如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置

31、在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！ 4、泵头： 泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等） 5、过滤器： 当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。 6、排液阀： 此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。 7、手动进样器： 平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。 8、流通池： 在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作

32、或申请维修）。 9、工作站： 出现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。故障排除与诊断泵压不稳 1、泵头有气泡流动相脱气/大流量冲洗泵/用注射器抽取流动动相 2、单向阀故障清洗 若上述操作仍不能解决，可用异丙醇冲洗流动（无色谱柱冲洗，由手动进样器直接进检测器），流量为3-4ml/min,冲洗50分钟左右，然后重新安装色谱柱，更换流动相平衡，如此再不能解决泵压波动故障，可申请更换配件。 色谱的保养： 漏液处理： 流路堵塞问题： 缓冲盐的使用： 流动相含有盐分时，做完实验后一定要进行流路冲洗； 首先用水冲洗，打开排液阀用PURG键转换出原有含盐的流动相，然后关闭排液阀打开泵冲洗全部流路45分钟以上，如此更换流动相为水和甲醇混合液冲洗全部流路30分钟（此步骤一般可省去，根据