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1、免疫组化原理与步骤免蚪化操作规程.一、试验原理与意义免蚪叙化学又称免疫编鹿化学，是指带显色弼标记的待异性抗体在翅裂4UW位逋过抗原抗体反应和组蛆化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定渊定的一新技术。它把免发反应的特异性、蛆场化学的可见性奇妙地结合起耒，借助星微传(英光星例h电子显微制的显像和放大作用，在编魔、及场鹿水平检涌各种抗原物质(tn量白质、多肽、谶*、病原体以与受体等)。二、试验微波炉、吹战机、坦化第、0盒、烯箱、提善善、染缸、光学里Ira、纯木浆卫生锻、计时善和通风播售。三、试剂配制.1. 0.01MPBS(pH7.34):9.0gNaC1.+50m1.0.2MPB加双篇水至1
2、000m1.;I(XX)m1.0.2MPB(pH7.4)=5.93gNaH2PO42H20+58.02gNa2HPO412H2Oin1000m1.双蔡水或=19OmIA+81Om1.B(A.0.2MNaH2PO42H2O:15.6gin5m1.ddH2O;B.0.2MNa2HPO412H2O:71.632gin10m1.dH2O)。2. CitrateBUfferedSa1.ine(0.01M曰械，PH6.0):28m1.A72m1.B2m1.ddH2O(A.Citrateadd(11):10.5g加双蒸水至100Om1.;B.Citratesodium(柠棣戢制):29.4Ig加双燕水至10
3、0om1.).3. 编制ft透液：由终浓度分别为0.3%双氧水希0.3%TritonX-1.混合而成。配制方法是先用徵波加蒸的36m1.PBS,再接着加120u1.TritonX-100,并加热一儿，冷却至临用首加0.4m1.30%H2024. 5%羊血清或封闭血清，用PBS稀拜。5. 含0.03%H2O2的0.05%DAB(避光)：用20DAB(1%,10mgm1.)5u1.+0.1u1.30%H2O2+95u1.PBSe6. 一抗、二抗均用PBS稀稀。7. Xy1.ene、梯度Ethano1.(1%2.95%、80%、70%、50%)、双燕水、中性相胶(封裱剂)。8. 苏木精染液：四、搽作
4、步H1、脱、水化一1) 601C2OminXy1.ene210minutes;2) 100%abso1.uteethano1.：2X5minutes;3) 95%ethano1.2minutes;4) 80%ethano1.2minutes;5) 70%ethano1.2minutes;6) disti1.1.edwater:5min;7) PBS洗3次X3min。2、编期间、封闭内源性过M化8）用封闭St透液浸潮切片30min（RT透光）此法是用覆赫40m1.PBS加120u1.TritonX-IW加需几分仲后,借用前加4u1.30%H202.9）PBS溶液洗3次X3min。3、抗原修复啾原
5、确定族10）切片放入0.01M柠醺加级冲溶液（PH6.0）后，在软波炉里高火4min至沸后，再加蒸妁6min4次，每次间隔补足液体，防止干片。4、封闭非常异性M白H）PBS溶液洗3次X3min;12）将切片取出,四周水分用逑锻嗖干,用蛆化婚在蛆叙四周上,在国内蛆织送入5%羊血清（与二抗来源一样）后放入程盒中,室温30（10-30）min;5、一撤殖.13）甩去切片上的羊清,用海锻擦干他仅四周残留血清，干腌加入已彝寿的一抗（1:250、500、I（XX）后，放入双念中如11小时，然后4度过夜，从冰箱中取出借37（复温45min。6、二抗期育.14）将一抗倒掉并用PBS洗5minx5次；15）用海
6、蹄国四周的水吸去,加入已弗爵的二抗后放入37rma烯箱中30min（回收）16）用PBS洗5次X5min;7、SPR&17)加入SP后放入37度将箱中30min。18)用PBS洗5次X5min;8、艮色.19)加入DAB(快逮法入，视察染色状况，倒掉染液)，显色时间限制在妁5min(3-10min),由俄下视察色限制时间。0.05%DAB(透光)(1:20储备液):5u1.20DAB+0.1u1.30%H2O2+95u1.PBS1%DAB储备液的制:5OmgDAB+5m1.0.05mo1.1.PBS充分溶-20P保存。9、复染、脱水、透亮、封片20)用PBS3次X3min后，用双燕水洗5min
7、;21)加一大法苏木索染液,鹿核量白染几秒，出血曦,白染2。8后自来水冲洗，双蒸水洗5min,再用PBS返藤5min22)脱水：50%ethano1.1-2min970%ethano1.1-2min95%ethano1.1-2min;95%ethano1.1-2min;100%abso1.uteethano1.:(1-2)min;100%abso1.uteethano1.:(1-2)min(23)逡亮：Xy1.ene1(1-2)minXy1.ene2(1-2)min24）封片：中性树皎。五、留意制1. 苏木索复染时间然要摸索,尤其阳性染色也在编质核上。2. DAB显色时间须要达到量优化，值下视
8、察达到阳性染色明显但背景不太深。3. 抗体导育时间和抗体浓度蛛摸索。尤其一抗得育好在4度过夜。4. 切片展和水化要充分；加反应液时要覆费粗细充分；每次加液前甩干洗濠液，但又防止干片；用倒化空看时尽大一点，否则墨水持斥液体，引起片周边干片。5. 片子着色不匀离的缘由如下：脱不充分。可以60t婷如min,马上放入焦新的xy1.ene1.; 水化不全。应常常配制焦新的梯度乙R;抗体没混匀。用移液譬充分混匀一抗/二抗等试剂； 抗体辱育时，切片放假科； 抗体导背后PBS冲洗不充分。 制片厚常不匀需等问题。染片盒不平，切片假斜。6. 一杭从4t拿出后，为什么有人说要37度复混，目的是什么？一方面，防止切片
9、从4t干It放入PBS易脱片；另一方三,使抗原抗体结合更定。一般不须要,但对表达较野的抗原可能有用,4r和37t度时分子运动方式不同,苜者分子磁撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但性也提育了并易造成非特异染色。7. 切片染色后背景太深，不易区分特舁性与非特异性着色？抗体导育时间过长、抗体浓度商易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗得育时间、稀祥抗体来限制；一抗用多克抗体曷出现非特异性着色，建议试用单充抗体*；内源性过氧化物和生物索在肝脏、肝触等R含假商，织要遢过迷长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；非带弹性想分与抗体结合，这阳要通过遥长二抗来源的动物免疫清封闭时间和适当增加浓度未加封闭效果；DAB显色时间过长或浓度过商；PBS冲洗不充分，残皙抗体结果增加着色；标本染色过程中出现干片，易增加非特鼻性着色。建议修到杭州百，生物的主页上来M,有具体的步H,我们也可以专业代眄蝴化MiM!
