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1、课题编号（）潍坊医学院2021年度国家级大学生创新创业训练计划项目结题报告课题名称：雄鼠暴露于双酚A对子代小鼠睾丸周期调控因子CDKl、Cdc25C的影响课题组单位：潍坊医学院课题组负责人：任珈乐课题组成员：张金枝、公言芮、陈金亮、刘晓凯指导教师：丰岱荣、解美娜指导老师单位：潍坊医学院结题时间：年月日摘要目的：研究雄鼠暴露于双酚A(BPA)对子代小鼠睾丸发育和细胞周期调控因子Cdk1、CdC25c表达的影响。方法：健康妊娠ICR母鼠分娩后，随机分为对照组(玉米油)、BPA(IOOgkg)组。雄性仔鼠于出生第1天(PNDl)开始每天颈背部皮下注射药物，PND35终止给药，继续饲养至PND70,雄
2、鼠与正常雌鼠随机合笼，待雌鼠分娩后，雄性仔鼠饲养至PND35取材，分离其睾丸组织，通过苏木精-伊红染色法观察小鼠睾丸组织形态结构的变化情况，RT-PCR法测定睾丸内Cdkl和Cdc25cmRNA表达量变化,Western-blotting和免疫荧光检测睾丸内CdklCdc25c和P-CdC2蛋白的表达水平。结果：与对照组(玉米油组)相比，BPAloogkg组生精小管内各级生精细胞排列紊乱，生精小管管腔内径显著减小(P001),生精上皮的厚度显著增加(P005),初级精母细胞数量增多(P0.05)；Cdc25c蛋白的表达水平降低(P0.05),P-CdC2蛋白的表达水平显著升高(P0.05)0结
3、论：雄鼠双酚A染毒影响子代小鼠睾丸曲细精管的结构，细胞周期和减数分裂通路中关键基因出现异常表达，导致细胞被阻滞在G2/M期，从而干扰子代小鼠睾丸的发育和功能。关键词：双酚A；减数分裂；Cdkl；Cdc25c引言随着工业的发展，一些存在于环境中的人工合成的化学物质会模拟体内激素的生物学效应，干扰实验动物体内正常的内分泌功能，导致动物的雄性和雌性的性别变化以及发育的异常，对人类的健康构成了潜在的威胁。双酚A(bisphenolA,BPA),是一种人工合成的苯酚衍生物，属于典型的环境内分泌干扰物之一，作为一种常见的塑化剂广泛地应用于制造聚碳酸脂、环氧树脂等高分子材料，这些高分子材料广泛地用于制造杀菌
4、剂、染料、仪器设备、医疗器械、通信设备、食品包装材料以及饮料容器、餐具、婴儿奶瓶的生产，并用作牙科填充物的原料。BPA具有一定的雌激素特性，能产生较弱的雌激素效应和较强的抗雄激素活性，从而导致雄性生殖发育毒性。研究发现，BPA会影响原始生殖细胞的表观遗传信息，使其具有跨代的毒性作用。最新研究表明，BPA可以通过其雌激素效应引起基因表达发生变化，并可以通过DNA甲基转移酶的作用影响基因组DNA的甲基化水平,证明了BPA具有表观遗传效应。细胞周期依赖性蛋白激酶Cdk,是一种Ser/Thr蛋白激酶，通过对SeiTThr蛋白的化学作用从而实现对细胞周期的调节。Cdc25c是一种双特异性磷酸酶家族的细胞
5、周期蛋白，可通过去磷酸化激活Cdkl,进而激活细胞中的细胞周期蛋白Bl/Cdkl复合物并调节G2/M进程，驱动细胞周期。Cdc25c能使Cdkl第14位的苏氨酸(ThrI4)和第15位的酪氨酸(Tyrl5)去磷酸化,从而激活Cdkl,进而活化CdklZCyclinBl复合体，促进细胞从G2期进入M期四。有文献报道，Cdk被抑制后，会阻碍细胞分裂的进程。现有的研究表明，体外培养的大鼠生精细胞中加入特异性Cdk抑制剂可延缓减数分裂的进程rmL目前有关BPA对雄性隔代生殖毒性效应的研究较少，为探讨雄性小鼠接触BPA是否会对子代小鼠睾丸发育和精子发生过程产生隔代的毒理效应，故本实验通过研究新生期雄性小
6、鼠接触BPA对子代小鼠精子发生过程中Cdc25c、Cdkl和P-CdC2表达的影响，探究双酚A是否通过影响细胞周期相关基因(CdC25c和Cdkl)的正常表达进而影响精子发生过程，为BPA隔代生殖毒性的研究提供理论依据。-实验方法（一）实验动物购买12只ICR妊娠母鼠（购买单位：青岛市动物实验中心）。动物饲养期间控制室内噪音W60dB,温度为20-25C,相对湿度为40%-50%,保证饲养环境的通风状况良好，保证小鼠能够正常摄入每日所需饮用水以及颗粒饲料，保持饲养所需颗粒垫料干净清洁，每日查看实验动物的健康状态。（二）试剂仪器表1主要试剂主要试剂厂家双酚A(239658-50G,BPA)玉米油
7、（分析纯）超敏ECL化学发光试剂盒SP-9000通用型SP试剂盒蛋白上样缓冲液(P1040,5,含DTT)CDKl(AN21.2)：sc53219小鼠单抗美国Sigma-Aldrich公司美国Sigma-Aldrich公司上海Beyotime生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京SOErbio科技有限公司美国SantaCruz公司p-Cdc2(pY15.44):sc-136014小鼠单抗Cdc25C(F-5)：sc-55513小鼠单抗AlexaFluor488山羊抗兔荧光二抗Cy3山羊抗鼠荧光二抗DAPl溶液(即用型)美国SantaCruz公司美国SantaCruz公司美国Jacks
8、onImmunoResearchLaboratories公司美国JacksonImmunoResearchLaboratories公司北京SoIarbio科技有限公司Marker(26616)PVDF膜(YA1700,0.22m)PMSF(POlOO)RIPA裂解液(CW2333S,强)蛋白磷酸酶抑制剂混合物(P1260,Alkin-One,100)ProteaseInhibitorCocktail(P9599)美国Thermo公司北京Se)IarbiO科技有限公司北京Solarbio科技有限公司北京SOlarbiO科技有限公司北京SOIarbi。科技有限公司美国Sigma-Aldrich公司
9、上海净信科技有限公司德国Sartorius公司 德国Eppendorf公司美 国 Protein Simple 公司日本SANYO公司 日本Olympus公司 江苏康健医疗用品 有限公司美国Biorad公司 北京天创尚邦仪器 设备有限公司 上海双旭电子有限 公司（三）仪器设备表2主要仪器设备设备名称厂家JXFSTPRP-24型全自动样品快速研磨仪TE214S电子天平5804R冷冻型多功能台式离心机FluorChemQ化学发光凝胶成像系统MDF-1156型超低温冰箱Olympus光学显微镜XH-B型旋涡混合器小型垂直电泳转印装置系统TS200震荡摇床磁力搅拌器（四）实验方法1动物模型的建立健康妊
10、娠ICR母鼠分娩，将新生仔鼠随机分为阴性对照组（玉米油）、BPA（100gkg）组，每组三笼，分娩后处死雌仔鼠留雄仔鼠。雄仔鼠从出生第1天开始称取体重并按4lg注射量进行颈部皮下注射药物，第15天开始按2lg注射量进行颈部皮下注射,直至出生第35天终止给药，继续饲养至70天。70天后雄鼠与正常雌鼠随机合笼，分娩后处死雌鼠留雄鼠，子代雄鼠饲养至第35天，第35天小鼠断颈椎处死并迅速分离其睾丸组织。将一侧睾丸组织固定于4%多聚甲醛固定液中，另一部分睾丸组织放于超低温冰箱保存。2曲细精管结构分析新鲜剥离的睾丸组织置于4%多聚甲醛固定液中，分别在第12h和第24h对睾丸进行切口、切半处理，将一半的睾丸
11、组织置于石蜡包埋盒内流水冲洗过夜，依次置于80%,90%,95%,100%的梯度乙醇内使睾丸组织脱水，转置于二甲苯溶液内两次，将睾丸组织浸入溶解的石蜡相内，包埋完毕的蜡块放置在组织冷冻台上冷却，最后将所有蜡块置于室温干燥条件下保存，留备石蜡切片之用。将石蜡包埋的睾丸组织置于组织切片机上进行切片，制作成4m石蜡切片，烘箱烤片3-4h,处理完成的切片进行苏木精-伊红染色，染色后于显微镜下观察睾丸曲细精管形态变化。3免疫荧光法检测睾丸内p-cdc2.Cdkl和Cdc25c蛋白的表达情况将石蜡切片置于烘箱中烘烤2h,石蜡切片在二甲苯中进行脱蜡，依次在95%、80%、70%乙醇中脱水，柠檬酸缓冲液(PB
12、S)洗片(3minx5),枸檬酸缓冲液微波抗原修复，PBS洗片(3minx5),滴加3%H2O2溶液湿盒孵育15min,PBS溶液洗片(3min5),正常山羊血清湿盒37孵育30min,倾去血清滴加一抗Cdkl(1:100).Cdc25c(1:100),p-cdc2(1:100),冰箱4过夜,次日PBS溶液洗片(3min5),滴加荧光二抗(1:250),湿盒37避光孵育lh,PBS洗片(3minx5),滴力口4、6-二眯基-2-苯基口引喙(DAPI)湿盒孵育5min,PBS洗片(3min5),滴加抗荧光淬灭封片液，封片，各组于荧光显微镜下观察结果并拍照。4蛋白提取和Western-blotti
13、ng取约50mg的睾丸组织，洗去血液后，加入RlPA裂解液中充分裂解，提取蛋白，煮沸分装并冻存。制备5%浓缩胶与12%分离胶灌胶，蛋白上样，电泳(80V,12OmA)和转膜(300V,200mA)2h,使用0.05gmL脱脂奶粉封闭聚偏二氟乙烯(PVDF)膜Ih,后用IXTBST缓冲液漂洗，分别加入一抗Cdkl(1:1000).p-cdc2(1:1000).Cdc25c(1:300)以及内参-actin(1:1000)中孵育过夜。次日IxTBST(含氟化钠和帆酸钠)洗膜3次，5-1Omin/次，放入二抗(1:5000)内孵育lh。孵育后，用IXTBST洗膜3次，每次IOmin。最后，在PVDF
14、膜中滴加ECL化学发光溶液(A液和B液按1:1混合)，并在机器上曝光以进行显影。5组织总RNA提取和RT-PCR取约50mg去白膜的睾丸组织置于ImlTrizol中，根据Trizol试剂盒提供的方法，匀浆提取总RNA,通过核酸-蛋白质定量仪检测总RNA的浓度，A260/A280的比值鉴定RNA纯度。根据HIFIScriptcDNA合成试剂盒进行逆转录。按照2EsTaqMasterMix试剂盒进行扩增，以获得PCR产物，使用琼脂糖粉末制备2%的凝胶，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照保存，使用ImageJ对实验结果进行分析。表3用于RT-PCR的基因引物序列GenePrimersequ
15、encesForward5-GGGACGACATGGAGAAGATCT-3M-ActbReverse5r-CCTGGATGGCTACGTACATG-SrCdklForward5,-ATAGTGGCCATGAAGAAGATCAG-3Reverse5r-CAGGAACTCAAAGATGAGATACAGC-SrForward5LGCAAACCTAAGCATTCTATCG-3Cdc25cReverse5LCAGGACCTTATGAAAGGTATCCC-36统计学方法实验独立重复3.4次，所有实验数据均采用SPSS25.0统计软件，选择独立样本t检验进行各组间比较分析，实验数据以xs表示。检验标准按照P
16、VO.05表示差异具有统计学意义。二实验结果（一）雄鼠双酚A染毒对子代小鼠睾丸曲细精管结构的影响HE结果显示（图1）,对照组（玉米油组）小鼠睾丸组织结构排列整齐规律，生精小管管壁内各级生精细胞饱满，分层次排列规则，细胞层之间结构分明，管腔内有较多的处于变形期的精子出现。而BPAlOOgkg组小鼠睾丸组织生精小管上皮内各类生精细胞排列紊乱，生精细胞层数较多并且呈现无序状态分布，部分曲细精管内出现多核巨细胞，此外，我们利用ImagePro-PlUS对生精小管指标进行量化后发现，在双酚A暴露组中，生精小管直径未见明显差别，但管腔内径明显减小（PvOOl）,生精上皮的厚度显著增加（P0.05）.BPA
17、暴露组中，生精上皮中初级精母细胞数量增多（P0.05）,单倍体精子细胞数量减少（P.JBU!dJo Jqlunu aqj6040200ControlBP100图1雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸曲细精管结构的影响注：（A、B）分别来自对照组（玉米油）和BPA（100gkg）组的睾丸切片的代表性组织学图像，黑色箭头显示曲细精管中的初级精母细胞。（C）曲细精管的直径。（D）曲细精管的管腔内径。（E）生精上皮厚度。（F）初级精母数量。（G）精子细胞数量。与对照组相比，*P0.05,*尸0.01o标尺为50mo（二）免疫荧光检测雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸内CdkLCdc25c和p-cdc2蛋白表达的影响如图所示
18、，Cdkl蛋白主要在初级精母细胞中表达，与对照组（玉米油组）相比，BPAlOOgkg组Cdkl蛋白表达未有明显影响（图2）。Cdc25c蛋白主要在初级精母细胞中表达，次级精母细胞略有表达，与对照组（玉米油组）相比，BPAlOOgkg组Cdc25c蛋白表达呈下降趋势（P0.05,图3）。P-CdC2蛋白主要在初级精母细胞表达，与对照组（玉米油组）相比，BPAlOogkg组P-CdC2蛋白表达量有所增加，呈上升趋势（尸0.01,图4）。(A)(B)ControlBPAlOOOoooo8 6 4 2 ) gsu2C ouoso,lollu OUa。AY图2雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸细胞中Cdkl蛋白表
19、达的影响注：（A、B）分别来自对照组（玉米油）和BPA（100gkg）组CdkI免疫荧光结果图。（C）各组平均荧光强度定量分析。与对照组相比，*P0.05;*P0.01o标尺为50m0Ooooo8 & 4 22su0.=ouuouSOJOnu OUeJOAV图3雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸细胞中Cdc25c蛋白表达的影响注：（A、B）分别来自对照组（玉米油）和BPA（100gkg）组Cdc25c免疫荧光结果图。（C）各组平均荧光强度定量分析。与对照组相比，*P0.05;*P图4雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸细胞中P-CdC2蛋白表达的影响注：（A、B）分别来自对照组（玉米油）和BPA（100gkg）组p
20、-cdc2免疫荧光结果图。（C）各组平均荧光强度定量分析。与对照组相比，*P0.05;*PCdc25c和pcdc2蛋白表达的影响以目的蛋白P-CdC2、Cdkl和Cdc25c蛋白与内参-actin灰度值的比值来表示各组蛋白的相对表达量。Western-blotting结果显示（图5）：与对照组（玉米油组）相比，BPAlOOgkg组睾丸Cdc25c蛋白表达水平降低（P005）,P-CdC2蛋白的表达量有所增加，呈上升趋势（P0.05）o(A)(B)ControlBPA100图5雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸细胞中CDKLCdc25C和P-CdC2蛋白表达的影响注：（A）Cdc25c.Cdkl和P-Cd
21、C2的蛋白质印迹分析，B-actin作为内参。（B）Cdkl的相对表达水平。（C）Cdc25c的相对表达水平。（D）P-CdC2的相对表达水平。与对照组相比，*P005;*P0.01（四）雄鼠双酚A染毒对睾丸中Cdkl和Cdc25cmRNA转录水平的影响如图6可见，与对照组（玉米油组）相比，BPAloOgkg组睾丸CdklmRNA的表达水平升高，差异具有统计学意义（P005）oIiiControlBPA100ControlBPA100ControlBPAIOO图6雄鼠双酚A染毒对小鼠睾丸细胞中Cd-和CdC25cmRNA表达的影响注：（A）Cdc25c和Cdkl的琼脂糖凝胶电泳结果图,M-Ac
22、tb作为内参。（B）CdklmRNA的相对表达水平。（C）Cdc25cmRNA的相对表达水平。与对照组相比，*P0.05；*P0.01注：1未加模板；2未加逆转录酶；3对照组；4BPAlOOgkg组（五）IYlneI检测双酚A染毒对睾丸细胞凋亡的影响如图可见，与对照组相（玉米油组）比，BPAlOOgkg组细胞凋亡的表达水平降低，差异具有统计学意义（P0001）（A）（B）（C）Ii0.80.6争!0.4S0.20.0玉米油组BPAloO组Control（玉米油）BPAlOO组注：（A、B）分别来自对照组（玉米油）和BPA（100gkg）组细胞凋亡结果图。（C）各组平均细胞凋亡定量分析。与对照组
23、相比，*P005;*P001;*P0.001三讨论双酚A是一种具有雌激素效应的环境内分泌干扰物，具有酚气味和苦味，溶于丙酮、醇类、醛类和碱性溶液，微溶于四氯化碳，难溶于水。化学工业先后将BPA用作制造聚合物（如聚碳酸酯和环氧树脂）的单体，用作聚氯乙烯聚合末端的抗氧化剂和抑制剂，以及用作合成阻燃剂的前体。双酚A在人们的日常生活中得到了广泛应用，其中与我们生活密切相关的产品包括各种医疗器械、食品和饮料容器、塑料餐具、厨房用具、婴儿奶瓶等，人类接触双酚A的主要途径被认为是通过摄入发生的，次要途径可能是经皮吸收和吸入受污染的空气传播的灰尘，双酚A可以很容易地通过罐装食品和聚碳酸酯包装中的环氧树脂衬里穿
24、透食物源，由于罐头食品既便宜又方便，它们在发达国家的使用非常普遍，并且是摄入双酚A的重要来源口引。随着双酚A使用范围的不断扩大，人们对双酚A的研究也日益增多，双酚A暴露对健康造成多种不良影响，尤其显著的是对生殖系统的损伤。已有文献报道，环境内分泌干扰物对动物体内的雌激素、甲状腺素和睾酮等具有显著的干扰作用，但在临床上，其主要表现为生殖功能障碍、发育异常和代谢障碍。目前，研究环境内分泌干扰物和环境雌激素对生殖系统的影响已成为国际热点问题14。双酚A对生殖系统的影响引起了科学界的广泛关注。之前的研究大多数都集中在母体双酚A暴露的模型中，例如，靳冠通等将15只妊娠Od的雌性SD大鼠随机分为3组，灌胃
25、50L橄榄油，橄榄油中分别含有0、：!和10mg/kg的BPA,采用组织化学和酶联免疫吸附剂测定（ELlSA）方法，研究孕期双酚A暴露对子代大鼠的生殖毒性影响，结果显示，双酚A能够显著降低睾丸和附睾的重量，对器官发育和睾丸精子发生产生明显的抑制作用，从而导致精子质量下降。YuanyuanWei等发现孕期母体暴露于双酚A会干扰雄性后代睾丸DNA甲基转移酶的转录，破坏睾丸激素、雌二醇和雌激素受体的分泌，从而损害睾丸组织并影响潜在的生殖功能，干扰Fl雄性小鼠的睾丸发育口*为了评估父本暴露对后代发育的潜在影响，MartaLombo等采用成年斑马鱼进行研究，成年斑马鱼雄性在精子发生过程中暴露于双酚A,并
26、与未经处理的雌性交配。结果显示，双酚A会导致与早期发育相关的FO和Fl精子残余mRNA减少网。在MdSaidurRahman等研究中发现，父本的双酚A暴露能够减少睾丸生精上皮细胞的大小和数量来破坏精子发生，导致F0-F2后代的总精子数量下降,损害F0-F2和F3代小鼠的精子生育能力，并且父本暴露于双酚A会对精子发生、几个重要的精子功能和精子中的DNA甲基化模式产生不利影响，对后代的生育能力具有多代和部分跨代影响口，然而，有关雄鼠暴露于双酚A对子代小鼠生殖系统影响的实验研究较少，对子代小鼠睾丸发育及精子发生的机制研究尚不清楚，并且父本双酚A暴露对子代小鼠细胞周期调控因子的影响目前也没有明确的结论
27、。已有研究显示，雄性小鼠暴露于双酚A会阻碍精子发生和其后代的发育“叫新生小鼠双酚A暴露对其子代雄性小鼠的精子密度和精子畸形率造成了显著的影响，双酚A对雄性生殖的影响作用通过精子遗传到了后代，并且在其后代表现出来MO。本实验HE结果显示，双酚A实验组导致了小鼠睾丸形态学发生改变，生精小管内各类细胞排列紊乱，生精小管管壁内各类生精细胞之间有较大空隙，生精小管直径未见明显差别，而管腔内径明显减小,生精上皮厚度明显增大，初级精母细胞数量增多，单倍体精子细胞数量减少。证明了雄鼠双酚A暴露会通过隔代影响其后代睾丸曲细精管的结构。精子发生是一个多阶段的复杂的细胞分化过程，在生精细胞的生长、有丝分裂和减数分裂
28、过程中，需要信号传导来精确调控多种基因的表达。在有丝分裂和减数分裂过程中，细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶扮演着重要角色。减数分裂进程中，通过精准的细胞周期调节机制，各项细胞周期事件才能正确且有序地完成，而细胞周期调控系统的重要组成部分是细胞周期依赖性蛋白激酶Cdks(cyclin-dependentkinase,Cdks)2，1O细胞周期的持续激活受到Cdk的控制。Cdkl是Ser/Thr蛋白激酶家族的成员，最早发现于非洲爪蟾的未受精卵母细胞P”细胞周期分裂因子25(Celldivisioncycle25,Cdc25),其表达产物是一种Thr/Tyr双特异性磷酸酶，它能将细胞周期蛋白依赖性激
29、酶Cdkl分子中的磷酸化位点发生去磷酸化，从而活化细胞周期蛋白Bl/Cdkl复合物，促进细胞G2/M期的转变现。细胞周期依赖性蛋白激酶Cdkl与细胞周期蛋白B(cyclinB)结合形成复合物成熟促进因子(M-phasepromotingfactor,MPF),MPF是调控动物精母细胞减数分裂过程中G2/M期转变的关键调控因子。MPF的活化是G2期进入M期的必要条件Ml,在G2期转变为M期期间，Cdc25c进入细胞核内，催化游离态Cdkl第14位苏氨酸和第15位的酪氨酸去磷酸化，Cdkl被激活，进而激活CdkI/CyclinBl组成的复合体，细胞减数分裂进程拉开序幕磔。因此，我们检测了细胞周期调
30、控相关因子的转录和翻译水平，来探究雄鼠暴露于双酚A对子代小鼠睾丸发育和生精细胞分化过程的影响。本实验结果显示雄鼠双酚A染毒导致子代小鼠睾丸内pcdc2蛋白表达上调、Cdc25c蛋白表达下调，Cdkl蛋白表达未受影响；而Cdkl的转录水平上调、CdC25c的转录水平未受影响。我们推测，雄鼠双酚A染毒导致子代小鼠睾丸内Cdc25c蛋白表达下调，进而导致CdkI去磷酸化水平降低，Cdkl蛋白未有明显变化，因而无活性的磷酸化状态的MPF可能大量积累，使细胞阻滞在G2/M期。通过进一步检测雄鼠双酚A染毒后子代小鼠睾丸内p-cdc2蛋白的表达发现,p-cdc2蛋白表达水平上调，证实了我们的推测。磷酸化状态
31、的Cdkl与cyclinB形成的复合体无激酶活性，不能正常促进细胞从G2期进入M期，因而小鼠生精细胞减数分裂过程被阻滞。对于实验结果中，转录水平与蛋白翻译水平趋势不同的问题，我们推测双酚A可能不仅影响了睾丸内细胞周期调控相关因子的转录过程也可能影响了其转录后翻译的调控过程。综上所述，新生期雄鼠暴露于双酚A能够干扰子代小鼠生精细胞的减数分裂过程，细胞周期和减数分裂通路中关键基因出现异常表达，干扰小鼠生殖系统的发育和功能。双酚A可能通过下调睾丸内Cdc25c蛋白的表达，造成Cdkl去磷酸化水平降低，磷酸化状态的Cdkl与cyclinB形成的复合体无激酶活性，导致细胞被阻滞在G2/M期，从而干扰生精
32、细胞的分化过程。对于细胞周期调控相关因子的转录和转录后翻译水平趋势不同的问题，后续我们将继续深入探讨。雄性小鼠接触双酚A能够干扰子代小鼠生精细胞的分化，破坏睾丸组织的正常形态结构。BPAlOOgkg组与对照组相比生精小管直径未见明显差别，而管腔内径明显减小，生精上皮厚度明显增大。且BPAlOOgkg组生精小管内部生精细胞呈现无序状态分布，雄鼠双酚A暴露会通过隔代影响其后代睾丸曲细精管的结构。雄鼠双酚A暴露引起BPAlOOgkg组的小鼠睾丸内p-cdc2蛋白表达上调、Cdc25c蛋白表达下调，Cdkl蛋白表达未受影响；而Cdkl的转录水平上调、Cdc25c的转录水平未受影响。双酚A可能通过下调睾
33、丸内Cdc25c蛋白的表达，造成Cdkl去磷酸化水平降低，磷酸化状态的Cdkl与cyclinB形成的复合体无激酶活性，导致细胞被阻滞在G2/M期，从而干扰生精细胞的分化过程。参考文献1靳翠红，赵剑，金一和，蔡原.双酚A对雄性小鼠生殖系统的影响J.中国医科大学学报,2002,(02):43-44.2孙延霞，刘基芳，宋祥福，栗学军，石贵山.双酚A对雄性小鼠生殖毒性的影响J.中国比较医学杂志,2008,(07):33-35+8L3蒋志惠，谢文艳，李新平，张小莺.环境雌激素双酚A暴露现状及其雄性生殖毒性研究概况J.生态毒理学报，2016,11(04):1-9.4李耿奇.BPA暴露导致F2代胰岛素抵抗的
34、效应及其表观遗传机制研究D;华中科技大学,2014.5李凯.环境雌激素双酚A对雄性小鼠生殖系统的表观遗传学效应D;哈尔滨工业大学,2012.6 MurrayAndrewW.Recyclingthecellcycle:cyclinsrevisitedJ.Cell,2004,116(02):221-234.7 LiuKai,ZhengMinying,LuRui,DuJiaxing,ZhaoQi,LiZugui,LiYuwei,ZhangShiwu.TheroleofCDC25Cincellcycleregulationandclinicalcancertherapy:asystematicrevi
35、ewJ.Cancercellinternational,2020,20(01):213-229.8莫发荣.细胞周期蛋白Cdc25C的研究J.生命的化学，2010,30(06):889-892.9 ChapmanDL,WolgemuthDJ.RegulationofM-phasepromotingfactoractivityduringdevelopmentofmousemalegermcellsJ.Developmentalbiology,1994,165(02):500-506.10 MurielleG,AnneD,SandrineM.Keyroleforcyclin-dependentki
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