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1、项目编号:厦门医学院“大学生创新创业训练计划”项目结题验收表所在系：药学系项目名称：仙景槟榔芋病毒RT-PCR一步式快速检测体系的建立项目负责人：李欣霞学号:项目类型：因创新训练口创业训练口创业实践项目级别：国家级IZI省级口校级指导教师：曾颖指导教师单位：厦门医学院项目起止：2020年6月至2022年6月教务处20年月日项目名称仙景槟榔芋病毒RT-PCR一步式快速检测体系的建立项目负责人姓名李欣霞性别女学号所在系药学系E-mail电话主要成员(不含负责人)姓名性别所在系专业班级学号项目分工吴玲玲女药学系18生物制药2班病毒RNA提取与优化王靖女药学系19生物制药1班整理数据林雅莉女药学系19
2、生物制药1班RT-PCR体系的探索蓝建明男药学系19生物制药1班收集资料指导教师姓名曾颖职称实验师学历/学位硕士研究生单位厦门医学院药学系邮箱联系电话项目结题报告(一至六项字数不少于5000字，可根据需要另加页)一、项目简介及项目创新点本项目以厦门市集美区灌口镇田头村仙景社的名优地方品种一一仙景槟榔芋为研究目标，通过分子生物学手段(RT-PCR)检测该芋种现存的病毒病种类及其发病率，同时从反转录和PCR等方面优化RT-PCR反应条件及步骤，构建一条快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR一步式病毒检测体系，为未来仙景芋的种苗脱毒人工繁育及田间试验提供技术保障，提高芋的品质和产量，将生物学技
3、术运用到实际农业生产中去，从而助推地方农业产业振兴与发展。本项目将依托灌口镇田头村仙景芋种苗脱毒育种的科技计划项目展开。前期已进行多次田间调研及农户座谈，基本掌握仙景芋种植情况及病害问题。仙景槟榔芋，属天南星科芋属，产于厦门市集美区田头村仙景社，是厦门市的名优地方特色品种，以其口感松酥、软糯、细腻著称，2001年注册“仙景芋”商标。仙景芋栽培历史悠久，清朝光绪年间已有记载且闻名内外。1972年尼克松访华期间，仙景芋被选为国宴用料；厦门市南普陀等各大知名餐厅长期将仙景芋作为固定供应食材。仙景芋市场遍及港澳及东南亚地区，更有民间传言“买芋头就买仙景芋”。仙景芋虽具有良好的品牌基础和市场竞争力，但常
4、年处于供不应求的状态，主要是由于目前芋的种植和留种方式较为传统，多年来均采用子芋自留自繁的自然选择型种植方式，导致芋的病毒病常年留存于芋种苗内，致使芋种性退化、种源带病、种质不稳，产品质量安全难以保障，最终无法形成标准化和规模化的现代化生产种植模式。芋是许多太平洋岛国和非洲国家(如斐济、巴布亚新几内亚、科特迪瓦、加纳等)的传统主食，也是他们重要的进出口物资。芋作为中国贸易量最大的水生蔬菜，其产业的发展对促进农民就业增收,农产品特色优势区的建设发挥了重要作用。我国作为芋头生产大国之一，芋头的出口总量和出口总额远高于进口总量和进口总额，2016年出口量占世界芋头出口量的81.6册芋(COloCaS
5、iaesctdentaL.Schott.)是天南星科(AraCeae)芋属，多年生宿根草本植物，为一种典型的无性繁殖作物，通常采用球茎播种方式进行轮作，但其病毒很容易通过种子团在体内蓄积，逐代感染芋种子造成品种严重退化，严重影响作物的产量和质量。芋受多种病毒侵染，且复合侵染严重，芋病毒病是严重影响芋产量和品质的主要病害之一。现有研究表明，芋头在植物中有各种病毒感染，有些病毒是通过介质传播的，许多病毒在无性繁殖过程中在植物体内积累，导致变异病毒不断发展，造成了芋种性退化，产品质量与产量逐年下降，种植成本高但经济效益低，现有种植户数量不断减少，产业发展受限。据国内外文献报道，目前侵染芋的病毒主要有
6、8种：芋花叶病毒(DaSheenmosaicvires,DsMV)香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus)、大杆(菌)状病毒(Largebaci11iforInvirus)小杆(菌)状病毒(SnlaIlbacillifornlvirus)芋瘦小病毒(COloCaSiabobonediseasevirus,CBDV)芋叶脉缺绿病毒(TaroChIOrotiCveinvirus,TCVV)(PearsonMN,1999)及黄瓜花叶病毒(CUCUmbermosaicvirus,CMV),国内报道发现的仅有芋花叶病毒(DaShCenmOSaiCvirus,DSMV)和黄瓜花叶病毒(CU
7、CUmbermosaicvirus,CMV),其它几种病毒只在斐济、巴布亚新几内亚等太平洋岛国有发现报道，而其它国家和地区的芋病毒种类尚未有系统研究。在侵染芋的几种主要病毒中，仅有DSMV研究得较为深入，而其它几种病毒的研究则十分有限，其相关生物学和分子生物学信息还不清楚。近年来，随着我国芋头生产新技术的不断提高与应用，加之种植面积的逐步增加，芋头产量也呈现了逐年上升的趋势。在生产中，芋头主要是以无性繁殖的方式来繁育后代，因此，病毒不断积累，且病毒复合侵染的现象也很普遍，这些病毒主要包括芋花叶病毒、芋杆状病毒和黄瓜花叶病毒等，进而造成其品质变劣和产量下降，严重影响了我国芋头产业的发展：其中，D
8、SMV为芋头生产上分布最广、危害最大和研究报道最多的病毒种类。该病毒侵染芋头以后，往往造成植株的生长势下降，芋头的球茎变小、数量减少，以及品质变劣等特征。芋长期利用球茎进行营养繁殖，已普遍受到芋花叶病毒的侵染。感染病毒的植株生活力降低，球茎大小、数量和品质下降，其产量损失近60%,并且，芋种越冬较困难，生产周期长，不利于新品种的及时推广，严重影响芋的生产、出口及国际间种质资源的交流和保存工作。到目前为止，还没有一种有效的防治措施，因此进行芋的脱毒研究，建立脱毒种芋繁育体系，以满足生产所需。茎尖培养是感病植株获得无病毒材料的最有效手段。DsMV最早于20世纪60年代在美国佛罗里达州由ZettIe
9、r等发现，并确定为马铃薯Y病毒属（PotyVirUS）的成员。该病毒可经种苗、种子、机械摩擦和蚊虫、粉介等媒介昆虫传播。由于天南星科植物以无性繁殖为主，所以病毒主要随着这些小苗、小芽或植物组织等繁殖材料而传播，此外在种植和田间管理期间的人工操作可造成机械摩擦传播病毒，在自然条件下，此病毒在天南星科植物问的传播主要是通过桃蛎、棉螃和豆蛆等以非持久方式传播。CMV的寄主范围十分广泛，侵染寄主后可以表现多种典型的症状。其中常见的有花叶和植株矮化；此外，还有系统坏死等症状。该病毒在自然条件下主要通过种子、苗木等繁殖材料或介体昆虫传播；据报道，至少有75种蛇虫能以非持久传毒的方式来传播该病毒，在特定条件
10、下，大约有20种病毒可以通过种子传播，同时，能传播该病毒的菟丝子多达10余种。根据仙景槟榔芋种植过程中出现的病毒病判断可能存在的病毒种类，设计相应的特异性引物对，通过对试剂浓度和反应条件进行优化，建立一步法快速检测芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus,DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的RT-PCR检测体系，为仙景槟榔芋病毒的高效检测提供有效手段，同时为该芋种苗人工脱毒繁殖提供技术支持。项目的创新性，其研究对象为当地特色品种一仙景槟榔芋，目前对该地方品种尚未有相关研究。本研究运用了灵敏度高、快速且特异性强的最新病毒检测方法一RT-PCR技术，
11、对目标芋种进行病毒检测与分析，同时建立一步快速检测多种芋病毒的体系。并且对芋病毒样本RNA提取步骤的单因素优化。二、项目申报时的预期效果（1）获得仙景槟榔芋的主要病毒种类；（2）构建并优化一步式多种病毒RJPCR体系，获得一条快速病毒检测方法；（3）撰写实验总结报告或相关论文。.三、项目实施情况（就研究目标、研究过程、研究成果、研究体会和心得作全面总结）本项目旨在通过分子生物学技术手段(RT-PCR)对传统种植的仙景芋病毒病进行快速检测分析，建立一条快速简便的检测方法，为后续种苗脱毒实验、实验室人工育种及田间试验提供技术支持，真正将理论知识运用于实践，服务地方农业产业，为乡村产业振兴做贡献。在
12、厦门市集美区灌口镇田头村仙景社采集带有病毒性状的叶片，芋花叶病毒大多产生羽状花叶、收缩、叶脉和茎的坏死、黄绿色斑纹等。严重程度与菌株抗病性、病毒系统、环境温度以及植物肥水管理状况有关；黄瓜花叶病毒可出现花叶病、植株矮化、全身坏死等症状。目前国内对植物RNA提取的优化多在提取所用试剂的选用上，通过对过程方法的优化研究较少，本研究从植物叶片研磨过程的角度通过正交实验确定了一条高效提取芋叶总RNA的路径方法，以获得高纯度和浓度的芋叶总RNA；并在此基础上构建针对DsMV的快速、简便、灵敏度高、特异性强的一步式RT-PCR病毒检测体系，为芋病毒快速检测提供了高效简便且灵敏度高的技术手段。对后续农作物相
13、关的脱毒快繁、抗病毒育种及种性提质方面的实验研究提供新思路。收集分装好的样品，进行RNA提取，在植物提取RNA的过程中，植物组织总RNA的提取是基因体外翻译、构建CDNA文库、研究基因的表达和调控，由于高效快速的提取无污染的完整的植物病毒RNA是对其进行基因表达分析和基因克隆的必要条件，因此研究对RNA提取条件，研磨时间、研磨频率、钢珠个数等方面进行优化，通过浓度的数据进行整理和分析，所得出最佳条件为研磨时间25Inin,研磨频率30(ls),钢珠1个。根据NCBIGenBank中收录的DsMV病毒外壳蛋白(CP)基因核苜酸序列的保守区域设计病毒引物。通过CDNA试剂盒将所提的RNA进行逆转录
14、，再以文献中芋病毒的PCR体系进行优化。其中，CDNA合成反转录体系(20HL)取芋叶总RNA样品5Ug作为模板，按照CDNA试剂盒说明书的操作步骤完成CDNA链的合成，具体操作步骤为：(D将提取的RNA与试剂在冰上解冻。(2)该反应体系体积数为20uL,其中OIigod(T)IUL,TotalRNA5uL,5TURE4L,用RNaSe-FreeddH20补水到20ULo(3)充分混匀后，42孵育30min；85C孵育5S之后放于冰上，得到的CDNA低温保存待用。PCR反应为(1)PCR体系(25UL)：模板为cDNA2.0L,上游引物(10Umol/L)1.0UL,下游引物(10molL)1
15、.0L,dNTPs0.5L,10Taqbuffer(Mg2+)2.5ULTaq酶0.2L,用ddH20补足25UL。阴性对照模板为2.0IILddH20。阴性对照模板为1.0ULddH20。(2)反应条件为：94预变性3min,94变性30s,56C退火30s,72C延伸Imin,循环35次；最后72延伸IOmin。PCR反应结束后，取出扩增产物5ML进行琼脂糖凝胶电泳检测。实验设三组平行，反复验证，重复性强。根据文献体系参考对一步式体系进行优化，得出一步式RT-PCR总体系(25L)：模板为芋叶总RNA1.0L,10PCRbuffer2.5L,Mg2+1.2L,10mmol/LdNTPs1L
16、,20PnlOl/L上游引物和下游引物各1L,逆转录酶LOL,5ULTaqDNA聚合酶1.0L,ddH20处理水补足25L。阴性对照模板为1.0ULddH20。反应程序：4260min,94C变性30s,55退火30s,72延伸1min,30个循环，72延伸10mine反应结束后，取出扩增产物5L进行进行琼脂糖凝胶电泳检测。利用现的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选取特异性好、产量高的PCR产物送往公司进行测序。在最终的芋病毒检测结果中，仙景槟榔芋只检测出了DSMV,而未有检测到CMV,因此我们构建出DSMV的一步式体系，对其反应体系进行单因素优化，由于高效快速的提取无污染的完整的植物病毒RNA
17、是对其进行基因表达分析和基因克隆的必要条件，本实验也对对RNA提取过程中的研磨频率、研磨时间、钢珠个数进行正交优化。最终结论为研磨时间25min,研磨频率30(ls),钢珠1个，能获得含量纯度均最高的芋叶总RNA；DSMV总体系(25L)：病毒总RNA1.0L,10PCRbuffer2.5L,Mg2+1.0L,10mmol/LdNTPs1L,20pmol/L上游引物和下游引物各1L,逆转录酶0.5L,5ULTaqDNA聚合酶1.0L,ddH20处理水补足25L。反应程序：4260min,94变性30s,55C退火30s,72延伸Imin,30个循环，72延伸Iomin。反应结束后，取出扩增产物
18、5L进行进行琼脂糖凝胶电泳检测，送至上海生工进行测序，其两步式和一步式RT-PCR同源性分别为82.12%、82.40%,确定其扩增产物是DSMV的特异产物。项目从初期到后期，通过不断地研究与试验，得出提取芋叶病毒RNA的最优方案与检测芋病毒的两步式RT-PCR与一步式RT-PCR两种方法的最优条件，为日后仙景芋脱毒快繁提供了技术支持，也为该地产业经济发展打好了优良商品基础。通过参加这次大学生创新性实验计划项目，我获益颇多。从确定项目立意点，到撰写项目申请书;从立项审查的波折，到确定研究方案与寻找创新点;从制定详细的实施计划，到项目的具体研究，一路走来，我开始了解了之前离我们遥远的科研工作，我
19、从中学到了严谨的科研态度、坚忍不拔的钻研精神，敢于创新的实践勇气。历经了近两年时间的查阅资料，数据采集，模型构建和刻苦钻研，使我学到了很多我所感兴趣的、对我学习生活很有用的东西。这是一次难得经历，一次让我得到锻炼、得到成长的经历，作为当代朝气蓬勃的大学生，我们不仅要努力学习，更要懂得去思考问题，解决问题。在项目初期，由于知识方面的欠缺，我们进度较慢。通过询问指导老师、及时调整方案，花一段时间学习相关知识，在此过程中我理解到科研最重要的是要抓住项目所要研究的主要问题，再对研究方案做出合乎实际的设计，最后才能取得预期成果。我体会最深的是要勤于思考，要善于从不同角度分析问题。每个课题研究的都是新的问
20、题，没有现成的方案，需要自己去找文献查资料，从中，我学到了不少知识与技能，了解到去抓住问题的本质寻找规律，然后确定要创新的方向，不断地努力，独立思考。在创新方面，首先要确定创新的方向和目标，要始终围绕创新点，不能偏离主题，也不能随意猜测，而要有根据有目的地做出假设，再一步步通过实践去论证自己的猜测。其实，每一个伟大的成就都是这样“平凡”地一步一步实现的。该项目真正做起来才发现并不那么容易，需要做很多的工作，并且这些工作都还需要很大的耐心和毅力。比如早期的文献查阅、数据收集、数据计算及其分析、模型构建。整个过程中我认识到做科研必须具有一丝不苟的严谨态度，要本着对科研负责，对科学负责的态度，进行自
21、己的研究。项目是我们团队共同的项目，大家的目标是一样的，在团队合作中难免会因为观点的不同而产生摩擦，这时候需要我们以团队为重，以项目为主，全身心投入，并充分尊重团队中成员的意见和建议。我们组从项目立项之初成员之间的不太了解到现在发展成为很好的队友、很好的朋友，这也说明了我们的团队合作精神。每一个人的力量都是有限的，在团队中我们能聚集起每个人的能量，将其团队作用发挥到最大。在研究过程中，期间遇到了许多问题阻碍实验进度，团队通过协调各人时间，查找类似问题与查阅各类相关文献，积极解决碰到的每一项难题，在项目后期，团队已经能够十分熟悉与默契，熟悉芋病毒的生物学特性、分子生物学特性，以及RT-PCR的原
22、理与操作，按照实验室的严格规章制度进行实验安排，为后续体系与条件成功探出打好了夯实的基础。四、项目实施过程中存在的问题及改进设想、建议根据田间采集来的样品，叶片有类似病毒病症性状，但提取病毒RNA效果不佳，可能叶片中病毒含量过低或提取时损失过大；应重新进行采样，选择病毒病症性状的叶片，改善叶片RNA提取方案，提升提取效果，同时设计该病毒阳性对照。部分引物出现明显二聚体，引物特异性较差；根据该病毒的引物条件，重新设计病毒引物；要避免重复碱基，尤其是G。并且，Tm=58-60CGC=30-80%o3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。PCR扩增产物长度：
23、引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。所取的样品中芋病毒大多为芋花叶病毒，经过多次检测与各体系和条件的逐一探索，未能检出黄瓜花叶病毒，并且多次出现引物二聚体；再多次进行重复实验，重新设计黄瓜花叶病毒特异性引物，若始终没有条带，说明该地芋种不存在黄瓜花叶病毒或病毒含量极低。五、项目最终成果（-）成果统计（在以下括号内填写数量，无则填0）1、发表论文-L份，2、专利0_份，3、调研报告一0一份，4、软件0份,5、实物及说明匕份，6、设计方案0一份，7、图纸汇编0份,8、竞赛获奖0份,9、其他成果0一份（二）成果清单序号成果名称（获奖名
24、称及等级）成果形式作者（获奖者）出版社、刊物名或颁奖单位时间（刊期）备注1芋病毒病及其防治技术的研究讲屐论文（CN）李欣霞农业灾害研究2022年6期己录用，待发表（三）成果材料（提供佐证材料附在后面）1.论文录用通知单农业灾害研究国内乐短也出69CN361317/SJtMsrnaiCfAgricultunilGatXBtropboIogy出：ISSN2095-3305中国知网（CNKI）全文收录期刊万方数据数字化期刊群收录期刊用稿通知单箔值同志：您的来稿毒病及其防治技术的研究进展（文章编号：N2670）已通运辑部审核，拟在农业灾害研究杂志2022年6期发表（如遇特殊情况出刊时间“艇），版面费3
25、500元。为避免延误出刊，请在5个工作日内办理费用缴纳及完成入刊回执单传递等入刊手续。谢谢您对本刊的支持。农业灾害研究编辑部2022年3月25日2.论文首页芋病毒病及其防治技术的研究进展J季秋夜，头玲玲.甘r.何玉书T夏门医宇关.整建亶门.361023)S：于鹏为娘玩两可的小口鼻粉作和左衣M二专冬MMiQ方交.手道警以无W茶道、*=M.S题支鎏啊毒生亲力等/品秒遑化本文王芸原走了去年来SC为非手悯毒药科类、蛙状、分子王神宇柠悔的宇先之雯笄铲有较为常见的二葬手用毒豹柠后、公翦方云及穷冷技术乏胃三咨专还对来来大33*3中手5毒箕警、生工于*=4的产量与，量等美矢W仑基而冗拿考塞义.关M词：至行毒：
26、方涛；劳治技术J中图分鬓号：S412文时标积码IA文m号：ResearchandDevelopinentofTarbVirusDheaeandControITechnolog-LiXinXia.WuLinsliaZensYing*.HeYiuhuVWVVVVW*SA(JamjrSMcajCoii.Xiamewi6102iFiVnn.ChnaAbstract:TsrossbeencahkuedfbrmaxiyyeaninChmxaaSicallcashcrap-forbothfoodmdvableiTaroisusuaHyfepfodcdasxuaHyasdpinBdfbfmasyyears.s
27、oirishiilysuscq?tibletoviauisfeciosmdIeadtovanetydradainInthispaper.Thespecies,charaasnandsolcafbiolcicachasactrsticsoftarovisuesathtceandabroadMrecessVearswerewiewed.andtCharaaeristies.deletion0ehodsSndplantiascoaraltechDiqiiesOfSevefaIcosaxot2foviauesHefeswturizedItprovidestheoreticalaaaadfefrence
28、Siznificaacefofissua2theyiddandqmlityoftaroinfmrddpIaatinE.JKeyorsIv)IDSMV为马铃薯Y传与常；通过醉芭(种子)、机械或场虫赛介传播；产生羽状花叶、收箝、叶WWSAAA/脉和茎的环忠黄圣竺至故叫最早主Zettl-噂人于1960年代在美玉佛罗里达产发汨DSMV的V*AAAA/AAAAAA/收螭日期：作W簿介：季代噩：208-八*,诏建,Ih毛、本在、行允方向：生被工稚、eil:5%&527981*=:政C1939-)、文、至二、：-主:,?yl：.-gl63.=3卫金孽目：堡门医宇史大宇生之蕊色业词探才定费氏R目2020126
29、31033)；度门医宇克大宇生冬糠色业5注计之iS(S202112631032X)vj六、经费使用情况及分析项目总经费（元）15000名目用途金额（TC）备注论文版面费论文版面费0已支付3500,待报销专利申请费00调研、差旅费00打印、复印费00资料费00试剂等耗材费购买试剂耗材9258.2元器件、软硬件测试、小型硬件购置费00其它测序52经费已使用合计（元）9310.2经费结余（元）5689.8项目负责人签字：年月日指导教师评语请指导教师对该项目的研究路线、研究方法、研究方案、研究成果、经费使用情况等做出具体评价。该项目研究路线及研究方案设计合理，能熟练掌握并运用植物RNA提取技术、RT-PCR逆转录技术、引物设计、琼脂糖凝胶电泳技术等，基本能按计划进度完成实验内容，取得预期结果。己完成一篇CN论文，已录用，待9月份发表；同时完成一篇研究性论文，正在向科技核心期刊投稿中。严格按要求使用项目经费，其中论文版面费和部分材料费已使用，待后续报销。指导教师签字：年月日所在系意见对项目进行综合评价与建议，并对项目能否结题等情况作出说明。负责人签字（盖章）年月曰教务处意见角项一目进行综合评价与建议,项目能否结题等情况确说明负责人签字（盖章）年月曰评审结果（请打“J”）通过暂缓通过不合格
