《IC50计算方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《IC50计算方法.docx（12页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。
1、IC50计算方法IC50是指反应被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%,该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。半抑制浓度(或称半抑制率)，即IC50o在间接竞争ELISA标准曲线中是一个非常重要的数据，标准曲线是一个S型曲线。ICELISa中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为BO,添加了抑制物质的孔的OD值为BBBO%就叫做结合率，在结合率为50%时
2、所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50o一般IC50的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大浓度可以稀释后测。IC50为50%抑制浓度即BB0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。通常来说，试剂盒最大和最小量程应该是该抗体用来检测标准品的检测限，检测限分最大和最小检测限。检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值；定量限为实际检测时可以定量的最低的值；而最大检测限就是实际操作中抑制率达到100%时的药物浓度。检测下
3、限(LOD)对应的OD值:OD(LOD)=BO-3SD定量限(LOQ)对应的OD值：OD(LOQ)=BO-IOSD酶活力单位(U,activeunit)酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25,其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU,又称U）。另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat,规定为：在最适条件下，
4、1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6107U,l=16.67nKat酶的比活力（specificactivity）:是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。酶的转化数（KCat）:在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用抑制剂和酶的结合速度要看情况而定，主要和你的抑制剂有关，许多情况下结合得很快，但是也有slowbindinginhibitor（我最近做的一个就是，抑制剂和酶的平衡时间很长，中途加根本看不出变化，必须吧抑制剂和酶一起incubate15分钟，然后用底
5、物引发）.如果只是IC50,一个底物浓度就够了。但是IC50会随底物浓度的变化而变化，所以你要指定一个底物的浓度，发表IC50的时候要注明你底物的浓度。这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个，感觉上就会不专业。如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料（并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度，还有对底物的Km）,你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50o不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据，最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线。具体怎么做动力学找本书上就有了。简单的就是根据相关资料（新的酶就要看自己的感觉了）设计几个底物浓度，然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线
6、在引发后的几分钟都是线性的，而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10%底物的浓度你要高高低低地试几次，然后估算出Km的大致值（加许多底物让酶饱和，这个时候测出的速度应该是VmaX,Km就是使得速度为VmaX一半的时候的底物浓度）。然后你设计10-15个底物浓度点上及5倍Km,下及1/5Km,注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处。情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线（X轴底物浓度Y轴速度），处理后得到Km和Kcato我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km，要么是3Km或5xKm（饱和）。当然如果你有决心的话，最好是做个关于抑制剂的全动力学以得
7、出Kio具体的方法就是选58个底物浓度点，然后在每个底物浓度下测46个抑制剂浓度的反应速度，我一般是为保准确每个数据点重复23次，工作量不小，但是Ki不受其它因素影响，直接表征抑制剂对酶的结合能力，是适合发表的正式数据一、原理曝理兰，简称MTT,可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚飒（DMSO）溶解,用酶联免疫检测仪在49Onm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3 ）MTT:以PBS配制成5mg.mlz抽虑除菌，保存
8、在4?C4 ）DMSO（二甲基亚飒）5 ）96孔板6 ）酶联免疫检测仪7 ）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孑版，l104孔，细胞浓度可以调整。2 ）置37oCx5%CO2温箱培养使细胞贴壁。3 ）加入不同浓度的药物，如L5、10、40、50、80、160、320mgml的药物，时间依据实验需要,一般3天。4 ）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。5 ）每孔加入180Ul新鲜RPMI1640培养液，再力口入20ulMTT溶液（5mg/mlz即0.5%MTT）,继续培养4ho6 ）终止培养（可离心，1000rpm,10min）,小
9、心吸去孔内培养液。7 ）每孔加入150Ul二甲基亚碗（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪49Onm处测量各孔的吸光值。8 ）同时设置调零孔（培养基、MTT.二甲基亚飒），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTTx二甲基亚飒），每组设定3复孔。三、结果统计学处理所有数值以s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、M
10、TT,二甲基亚飒。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT.二甲基亚飒，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3 ）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液,再加入0.5%MTTz量为20ul孔。4 )如果不使用96孔板，培养基超过IOOml,MTT按照10%的比例加入。5 )MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mgml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。6 )对于DM
11、SO,溶解后呈紫(红)色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm,并且建议以655nm作为参考波长。7 )96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。8 )注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。9 )没有去掉上清直接加DMSO,沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，2000r
12、,5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。10 )为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。11)除置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。12 )关于如何计算IC50方法有多种改良寇式法:1g法50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)(2)BliSS法:自己查阅书籍(3) IC50计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50:http:/chiryo.phar.nagoy
13、a-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm13 ）计算抑制率，公式（对照-本底）-（给药-本底）/（对照-本底）*100%.MTT试验的一些细节问题（一）细胞L选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。14 药物浓度的设定。一定要多看文献
14、，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。15 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。16 培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h,如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向GO期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。17 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测
15、定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。18 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。19 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTTx二甲基亚飒。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTTs二甲基亚飒，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8,避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。（二）实验步骤贴壁细胞：L收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入Io
16、OUI,铺板使待测细胞调密度至IoOO-IOOOO孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2,37。C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔IOOuLiS3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2,37。C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4 .每孔加入20UlMTT溶液（5mgml,即0.5%MTT）,继续培养4h0若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5 .终止培养，小心吸
17、去孔内培养液。6 .每孔加入150Ul二甲基亚碗，置摇床上低速振荡IOmin,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7 .同时设置调零孔（培养基、MTT.二甲基亚飒），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碗）悬浮细胞：L收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度IXIo6/mI,按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul;加ActinomycinD（有毒性）IOuI用培养液稀释I7gmlz需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）;需检测物IOuI;细胞悬液50ul（即5l04cell/孔）,共IOOUl加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每
18、板设对照（加100?（储存液1001640）o2 .置37oCl5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3 .每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-I,培养4h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4离心（1000转XlOmin）,小心吸掉上清，每孔加入100Ul二甲基亚飒，置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5 .同时设置调零孔（培养基、MTT.二甲基亚飒），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培
19、养液、MTT,二甲基亚飒）,每组设定3复孔。（三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mgml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水
20、配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl8gKcl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g调ph7.4定容IL（四）关于细胞的接种（铺板）细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密
21、度多采用10000/mlr100ulJL细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.其它的声音：L首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孑IJ1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。IOoOO/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孑L,太少的话SD值会很大。2 .MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是
22、新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。3 .我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000-80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000-70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来
23、，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：L吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。IOmI的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。4 .吸管的吸液量最好在Iml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量Iml多的吸管，总液量在5ml
24、左右为益5 .吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4,吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）5,向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央,而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的
25、均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。（五）加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以IOUI即够了。如果不使用96孔板，培养基超过IOOuIzMTT按照10%的比例力口入加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性撷大，另外MTT稀释彳麦加入黜胞
26、前是需要以谩滤的方式滋菌宜,且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。（六）如何清除上清1 .加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r,5分钟，然后吸掉上清（如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可）。2 .我每次将M
27、TT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G,5mino但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！3 .另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2-3次，比用吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。4 .做MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。5 .加完MTT反应3-4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落,你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孑饭后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。6 ,用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸
