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1、项目编号：厦门医学院“大学生创新创业训练计划”创新训练项目申报书所在系:项目名称:负责人:联系方式:指导教师:指导教师职称:指导教师学历:指导教师E-maiI：项目申请日期:项目起止年月：基础医学部纳米药物载体用于肺癌靶向化疗-光热联合诊疗林丽萍林真亭实验师硕士2020年6月15日2020年6月2022年6月教务处2020年6月填写说明1、本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要，申报书请按顺序逐项填写，填写内容必须实事求是，空缺项要填“无”。2、申请人可以是个人，也可为创新团队，首页只填主持人。3、本申请书为大16开本(A4),左侧装订成册。可网上下载、自行复印或加
2、页，但格式、内容、大小均须与原件一致。填写完后用A4纸张双面打印，不得随意涂改。4、主持人所在系认真审核，经初评和答辩，签署意见后，将申请书(一式两份)报送教务处。日称项名纳米药物载体用于肺癌靶向化疗-光热联合诊疗所属学科基础医学申请金额30000元起止年月2020年6月至2022年6月主持人姓名林丽萍性别女民族汉出生年月2000年10月学号联系电话指导教师林真亭联系电话主持人曾经参与科研的情况参加2019年厦门医学院第五届“互联网+”大学生创新创业大赛，三等奖。指导教师承担科研课题情况1 .国家自然科学基金青年科学基金项目，PD-L1在树突状细胞来源外泌体移植排斥中的作用机制研究，2020/
3、01-2022/12,21万元，在研，参与。2 .省教育厅本科教改专项，FBJG,以创新创业为主线改革生物医学实验教学体系，2018-082020-08,2万，在研，参与。3 .校级（科技类），HXJB-17,纳米药物载体用于肺癌靶向化疗-光热联合诊疗，2019年12月-2021年12月，10万，在研，参与。4 .横向课题，HX201905,皮肤修复贴功效分析，2019/12/26-2020/12/31,10万，在研，参与。指导教师对本项目的支持情况实验技术指导，所需实验仪器设备和经费支持。项目组主要成员姓名学号专业班级所在学院项目中的分工林丽萍18医检2班厦门医学院主持人许微微18医检2班厦
4、门医学院相关技术检测熊盼18医检1班厦门医学院玻片制备，小动物饲养陈梓悦19医检4班厦门医学院细胞培养及提取朱德辉19医检4班厦门医学院细胞移植，样品保管二、项目简介（限200字以内）本项目拟将脂质体作为纳米药物载体，M13为模型药物，ICG为光热治疗剂，Tf和TAT为双重靶向配体，设计并构建一种新型双重配体修饰的共载化疗药物与光热治疗剂的脂质体（TfTAT-CG-M13-LP）o在此体系中，以DSPE-PEG3500-MaI和DsPE-PEGIOOO-MaI为桥联，通过硫醒键共价连接Tf和TAT,实现Tf和TAT在脂质体表面的共修饰，并同时在脂质体内包载ICG和M13。拟先借助Tf特异性识别
5、肺癌细胞上的TfR并与其特异性结合，旨在实现其细胞选择性，再借助TAT高效的膜穿透能力促进脂质体穿透肺癌细胞甚至到达深部，将化疗药物M13和光热治疗剂ICG同时递送到同一肺癌细胞中，利用ICG的光热效应增加肺癌细胞对化疗药物的敏感性，同时用ICG在激光照射下使肺癌组织局部温度升高杀死肺癌细胞，产生最大的细胞毒性，克服化疗产生的毒副作用和多药耐药性，克服单纯的光热不能完全杀死肺癌细胞的缺点，实现肺癌的靶向化疗-光热联合治疗。本项目对TfTAT-CG-M13-LP的制备工艺进行优化，并考察其有关性质；通过体内外评价，验证Tf/TAT-ICG-M13-LP在肺癌细胞中的靶向性和化疗-光热联合治疗效果
6、。三、立项依据（可加页）（一）研究目的本项目拟将脂质体作为纳米药物载体，M13为模型药物，ICG为光热治疗剂，Tf和TAT为双重靶向配体，设计并构建一种新型双重配体修饰的共载化疗药物与光热治疗剂的脂质体（TfTAT-CG-M13-LP）.通过体外细胞实验，明确TfTAT-CG-M13-LP对肺癌细胞有良好的靶向性和化疗-光热联合治疗效果。通过体内动物实验，明确TfTAT-CG-M13-LP对肺癌细胞有良好的靶向性和化疗-光热联合治疗效果。(二)研究内容Tf/TATTCGTl3-LP的构建及表征合成用于构建脂质体的关键材料DSPE-PEG10OO-TAT、DSPE-PEG3500-MaI,并进行
7、验证。采用薄膜分散-超声法制备PEG修饰的共载脂质体(PEG-ICG-M13-LP),以粒径和包封率为主要指标，考察PEG-ICG-M13-LP制备过程中的不同影响因素，筛选出粒径均匀、包封率较高的处方工艺。在基础上，分别通过插入法和有机相反应法，将Tf和TAT在脂质体表面上进行修饰，得到TfTAT7CG-M13-LP,并以粒径和包封率为主要指标，考察Tf/TAT-ICG-M13-LP制备过程中的不同影响因素，筛选出粒径均匀、包封率较高的处方工艺。采用透射电子显微镜考察Tf/TAT-1CG-M13-LP的形貌；采用马尔文Zeta粒度仪测定粒径、分散指数(PDI)及表面Zeta位；采用荧光分光光
8、度计及紫外分光光度计检测其光谱特征；采用荧光分光光度计和HPLC测定ICG、M13的载药量和包封率；采用荧光分光光度计和HPLC检测ICG和M13的体外稳定性、药物释放；并对红细胞溶血性进行考察。采用近红外激光发射器，以激光照射时间为横坐标，以Tf/TATTCG-M13-LP溶液对应的温度为纵坐标，绘制溶液的时间-温度曲线，分析TfTATTCG-M13-LP溶液的光热作用。TfTATTCGT13-LP的体外肺外向性和化疗-光热联合治疗研究分别采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪，考察小鼠LeWiS肺癌细胞对TfZTAT-ICG-M13-LP的定性和定量摄取。分别采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细
9、胞仪，考察Tf/TAT-1CG-M13-LP对小鼠LeWiS肺癌细胞内定位和摄取机制。分别采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪，考察小鼠LeWiS肺癌肿瘤球对TfTAT-1CG-M13-LP的定性和定量摄取情况。采用显微镜观察Tf/TAT-1CG-M13-LP对小鼠LeWis肺癌肿瘤球的生长抑制情况。采用流式细胞仪，通过双染色法考察开/1人一代6513-1对小鼠1_6叩15肺癌细胞的凋亡效果。CCK-8法检测评估Tf/TAT-1CG-M13-LP对小鼠LeWiS肺癌细胞的活力。采用近红外激光发射器，考察Tf/TAT-ICG-M13-LP对小鼠LeWiS肺癌细胞的光热治疗作用。TfTATTCGT
10、13-LP的体内肺靶向性及化疗-光热联合治疗研究采用小动物活体成像仪，定性观察各脂质体在荷瘤小鼠体内的分布及离体肿瘤的蓄积，评价Tf/TAT-1CG-M13-LP在荷瘤小鼠的体内分布情况。通过液相色谱-质谱联用技术（HPLe-MS）定量测定脂质体在肿瘤、血液及脏器中的含量，并通过统计学软件分析评价Tf/TAT-ICG-M13-LP的药代动力学特征以及在各组织中的分布。考察不同载药制剂对荷瘤小鼠的治疗效果，观察小鼠的生存期，并对治疗后的各组织切片观察病理情况，以确定TfTAT-CG-M13-LP对肺癌的靶向化疗-光热联合治疗效果。（）国、内外研究现状和发展动态肺癌为临床上最常见的恶性肿瘤，其发病
11、率和死亡率稳居各种癌症之首，2018年全球新发肺癌病例达例（占癌症总数11.6%）。根据组织学类型可将肺癌分成小细胞型（SCLC）和非小细胞型（NSCLC）。其中，非小细胞肺癌占比超过85%。肺癌恶性程度高，生存率低，已然成为严重威胁我国甚至全球人民健康的恶性肿瘤。目前,对于肺癌尚无特效的治疗手段,也缺乏早期诊断的方法。因此,加强对肺癌精准化诊断和治疗研究显得尤为重要。作为世界上最常见的恶性肿瘤，肺癌的相关研究也突飞猛进。然而，化学治疗、放射治疗、手术治疗仍是当前治疗肺癌的三种传统方法。这三种治疗方法的局限性也愈发突出，外科手术和放射治疗都是局部治疗方式，无法控制晚期转移，而且肿瘤患者大多身体
12、状况差，无法接受此类治疗。化疗药物均缺乏肿瘤细胞特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤大量骨髓及其他增殖旺盛细胞。近年来，肺癌精准治疗在靶向药物、免疫治疗等方面有了新的进展。联合使用免疫疗法、基因疗法、光动力疗法(PhotodynamicTheraPy简称PDT)和光热治疗(PhotothermaItherapy,PTT)等治疗策略的研究给肺癌的治疗带来新的希望。光热治疗(PhOtthermaItherapy,PTT)是近年来发展的一种微创性肿瘤技术，可以实现定点杀伤，极大地降低了系统毒性。PTT是指具有特定吸收波长的光热治疗剂将吸收的光能转换成热量，通过升高肿瘤组织局部温度而杀伤肿瘤细胞的一种
13、治疗方法。Pn多采用近红外激光作为光源，可辐照肿瘤组织深处，选择性地使肿瘤组织局部区域产生较高热量，而不对周围正常组织产生影响。理想的光热治疗剂应当具备良好的近红外光(650nr900nm)吸收性能，较高的光热转换效率，良好的生物安全性，无毒副作用，肿瘤靶向性等特点。其临床用途已得到高度评价,特别是用于治疗中央型早期肺癌(CELC)t791oPTT可作为早期气道肺癌的一种独立模式，或作为多模式联合手术、放疗或化疗的一部分。其系统免疫效应、在非手术适应的周围型肺癌中的作用以及联合免疫治疗在NSCLC患者中的潜在作用成为研究热点询。常见光热治疗剂包括金纳米材料、碳纳米材料、铜基半导体材料和叫味菁绿
14、(indocyaninegreen,ICG)等。噪菁绿(ICG)是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准，用于临床的近红外(NlR)荧光染料，因其光学特性和良好的生物相容性，被作为造影剂应用于荧光成像和光声成像皿。ICG分子能够强烈地吸收近红外光，将之转化为热能和单线态氧，可作为有效的热辅助治疗手段。在临床上，ICG被广泛应用于对肺功能、心输出量、视网膜的脉管系统的辅助诊断吐。它还能作为荧光探针发射波长为82Onm的近红外荧光，同时能作为感光剂，吸收光能并将其转化成热能或产生单线态氧，进而杀伤肿瘤细胞侬。然而，ICG也存在一些劣势，比如在水溶液中稳定性差、在血液循环中容易被快速清除(血液半
15、衰期2-4min)细胞摄取率低、分子间容易形成二聚体导致荧光淬灭、浓度依赖性、非特异性蛋白结合、非靶向性等，这些不足严重限制了ICG在肿瘤诊断及治疗方面的应用叱。近年来，纳米技术的快速发展为这一问题的解决提供技术支持，研究人员尝试利用各类纳米载体搭载ICG以期提高其稳定性、延长其血液循环时间并赋予其肿瘤靶向性出。纳米药物载体可以有效改善化疗药物体内特异性分布差的缺点，利用被动靶向和主动靶向提高肿瘤细胞内药物浓度，减少化疗药物对正常细胞的损伤，提高化疗药物的体内循环稳定性，有效控制药物释放，提高生物利用度。因此纳米递送系统在肿瘤的化学治疗和光热治疗中显示出广泛的应用前景。纳米药物载体为纳米技术与
16、药剂学最直接的产物，在控释药物、提高药物生物稳定性、利用度和引导多模态诊疗方法等领域具有诸多优势，为ICG分子的广泛应用提供平台。脂质体，作为纳米药物载体中最常见的载体，具有良好的生物相容性和靶向性，可以作为各类治疗药物的传递载体。当前已有研究表明.，用脂质体搭载叫味菁绿(ICG)能增强ICG的荧光强度,有利于作为手术导航的造影剂。但是单纯利用脂质体进行载药普遍存在包封率低的缺点，在血液循环中容易发生突释、稳定性差等问题，这些弊端在很大程度上限制了脂质体药物的发展和应用阿。因此，改进脂质体的制备处方和工艺，采取表面修饰等措施增加脂质体的稳定性，对于脂质体的后续研究具有重要的意义。将脂质体表面进
17、行必要的修饰可降低网状内皮系统的吞噬，从而增加其靶向性。一方面，可以在脂质体表面修饰聚乙二醇(poly(ethyleneglycol),PEG)链，形成空间稳定的脂质体，增加脂质体表面的亲水性，减少与血浆中调理成分的结合，从而增加其在血液中的稳定性，以此显著延长脂质体在血液中的循环时间；与此同时，PEG修饰的载体可以通过增强的通透性和滞留效应(EnhancedpermeabiIityandretentioneffects,EPR效应),在肿瘤组织蓄积实现肿瘤的被动靶向。另一方面，在脂质体表面修饰具有靶向性的分子，使其通过受体介导等途径到达肿瘤细胞网。转铁蛋白受体(Transferrinrece
18、ptor,TfR)是跨膜糖蛋白，相对分子量为170-0OkDa阴。TfR在人体内广泛表达，其中原始红细胞高达80%,脑细胞、肿瘤细胞、脑毛细血管内皮细胞、活化的淋巴细胞和成纤维细胞都有很高的表达。瘤细胞表面的TfR是正常细胞的2-7倍，肿瘤细胞表面TfR与转铁蛋白(TranSferrin,Tf)亲和力是正常细胞的10700倍)常见的各种癌症例如乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、皮肤癌等均与Tf有密切关系。团队采用Tf作为靶向配体传递药物到TfR高衰达的恶性肿瘙取得有效的结果2:证明Tf修饰的脂质体可以特异性靶向到肿疝部位。多肽类生物大分子药物通常具有较低的穿膜特性，这往往会限制其在临床上的应用。细胞
19、穿膜肽(Cellpenetratingpeptides,CPPs)通常是指一些小于30个氮基酸残基的短肽，这些小肽往往具有药物运输载体的潜力，CPPS能够携带大分子物质例如蛋白、多糖和核酸等进入细胞内部并且对该物质的活性不产生影响。CPPs的跨膜能力非常强大，通过细胞膜易位能够高效地直接透过细胞膜，而对细胞膜没有损伤，不受时间、能量和细胞类型的限制固。因此，CPPS作为药物运榆载体得到了越来越广泛的研究。TAT是一种常见的CPPs,是人类免疫缺陷病毒(HIV)的反转录激活因子，由十一个氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成，它不但自身可以跨膜进入细胞，而且能将与之相连的蛋白、多肽及DNA导入细胞
20、内，且细胞的正常结构和功能不受影响。团队前期证明了TAT能够促进脂质体高效快速进入肿瘤细胞，甚至到达肿疝深部如刈。在前期研究,中团队使用PEG用于修饰脂质体，同时选择转铁蛋白Tf和细胞穿膜肽TAT共修饰到脂质体表面，既保留了脂质体的长循环功能，又提高脂质体的靶向性和穿膜能力。Tf特异性结合肿瘤细胞上的TfR,使脂质体特异性到达肿瘤细胞，脂质体获得良好的肿瘤蓄积，此时TAT发挥其高效入胞的能力使脂质体穿透肿瘤细胞甚至到达肿瘤深部，大大增强了脂质体识别并穿透肿瘤细胞的能力。故本项目继续应用脂质体作为药物载体，以DSPE-PEGaSOOTal和DSPE-PEGWoO-Mal为桥联，通过硫融键共价连接
21、转铁蛋白Tf和细胞穿膜肽TAT共修饰到脂质体表面。中药在治疗肿瘤方面起到了十分重要的作用，其具有副作用小、病人耐受性好、价格低廉等特点。因此，中药作为天然化合物成分也逐渐成为抗肿瘤领域的研究热点。苦参碱是从传统中药苦参中提取的一种主要成分，其分子式是G5H2A2O,是一种重要的天然生物碱，由于其药理特性和临床的广泛应用而备受关注。苦参碱类生物碱具有多方面的药理学作用，如抗感染、抗病毒、抗心律失常、抗纤维化以及免疫抑制等。图1.M13化合物结构式近年来，苦参碱类生物碱及其衍生物，因其潜在的抗肿瘤活性，而被进一步研究。苦参碱具有一定的抗肿瘤活性，但它的生物利用度并不高，需要联合其它抗肿瘤药物使用，
22、从而限制了它的使用范围。王立升课题组网根据药物拼合原理，将同样具有抗肿瘤活性的苦参碱与哌嗪类化合物通过化学方法拼合成一系列新的苦参碱衍生物，并通过体内外抗肿瘤活性评价证明，27个哌嗪类苦参碱衍生物均具有不同程度的抗肿瘤活性作用，与空白组（模型组）相比均有显著性差异，有5个化合物的活性明显优于苦参碱和顺销。因此，本项目拟选用上述唳嗪类苦参碱衍生物中抗肺癌细胞活性最强的M13（图1）为抗肺癌的模型药物。抗肿瘤药物的耐药性极大地限制了化疗药物对抗肿瘤治疗的临床应用，可以通过在传统单一药物治疗系统中联合其它的治疗手段，从而达到对复杂疾病的系统性治疗。联合治疗抗肿瘤体系已被大量报道，如光热和光动力的联合
23、抗肿瘤、化疗与光热的联合抗肿瘤治疗等。大量研究表明，化疗和光热治疗的联合应用能协同诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死，近年来越来越受到研究者的关注阴。化疗结合热疗可以一定程度上增强化疗效果。化疗和热疗具有不同治疗机制，前者是多种肿瘤治疗中最常用的方法之一，后者用高热杀死肿瘤细胞，属于物理治疗方式。化疗和热疗同时作用存在多种机理，大量基础研究和临床应用显示两者具有协同作用削。因此，本项目拟将本质体作为纳米药物为体，M13为模型药物，ICG为光热治疗剂，Tf和TAT为双重靶向配体，设计并构速一种新型双重配体修饰的共载化疗药物与光热治疗剂的脂质体(TfzTAT-ICG-M13-LP)。在此体系中，以DSPE-
24、PEG3500-MaI和DSPE-PEGK)OrMal为桥联，通过硫酸键共价连接Tf和TAT,实现Tf和TAT在脂质体表面的共修饰，并同时在脂质体内包载ICG和MI3。拟先借助Tf特异性识别肺癌细胞上的TfR并与其特异性结合旨在实现其细胞选择性。再借助TAT高效的膜穿透能力，促进脂质体穿透肺癌细胞至到达深部，将化疗药物M13和光热治疗剂IeG同时递送到同一肺癌细胞中，利用ICG的光熬效应增加肺癌细胞对化疗药物的数感性，同时用ICG在激光照射下使肺癌组织局部温度升高杀死肺癌细胞，产生最大的细胞毒性,克服化疗产生的毒副作用和多药耐药性，克服单蛇的光热不能完全杀死肺癌细胞的缺点，实现肺癌的靶向化疗-
25、光热联合治疗。本项目对Tf/TAT-ICG-M13-LP的制备工艺进行优化，并考察其有关性质；通过体内外评价，验证工17工人一代613-1在肺癌细胞中的靶向性和化疗-光热联合治疗效果。引文：1. WuC,LiM,MengH,LiuY,NiuW,ZhouY,ZhaoR,DuanY,ZengZ,LiX,LiG,XiongW,ZhouM.AnalysisofstatusandcountermeasuresofcancerincidenceandmortalityinChina.SCICHINALIFESCI2019,62(5):640-647.2. BrayF,FerlayJ,Soerjomatar
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39、药物与光热治疗剂的的脂质体，并通过体细胞、体内动物实验，考察Tf/TAT-1CG-M13-LP在肺肿瘤细胞中的靶向化疗-光疗治疗效果。(五)技术路线、拟解决的问题及预期成果拟解决的科学问题(1) 丁丁41代6-乂13-1的成功构建及表征。(2) Tf/TAT-1CG-M13-LP对肺癌细胞有良好的靶向性。(3) TfTATTCG-M13-LP对肺癌细胞有良好的化疗-光热联合治疗效果。预期成果(1)明确Tf/TAT-ICG-M13-LP对肺癌细胞的化疗-光热联合治疗效果，为后期相关靶向药物的开发奠定基础。（2）发表学术论文一篇。技术路线-|有瘤小鼠生序期各组积定量分布工药代动力学特征-离体肝缗I
40、yl积工有病小双体内分布细胞凋亡I-te- 肝痔球穿透性-M胞内定位 工细胞摄取机制厂一细胞摄取（六）项目研究进度安排本项目的实施预计两年，分四大步骤：1.2020年6月-2020年12月：购买试剂耗材等，完成TfTAT-CG-M13-LP的构建及表征实验：包括DsPE-PEG100O-TAT.DSPE-PEG35OO-MaI的合成及鉴定，PEG-ICG-M13-LP和TfTAT-ICG-M13-LP的制备工艺及相关性质研究。2. 2020年12月-2021年7月：通过体外细胞实验，完成TfTAT7CG-M13-LP的体内肺靶向性及化疗-光热联合治疗研究：包括细胞摄取实验、细胞摄取机制实脸、细
41、胞内定位实验、肿瘤球穿透性实验、细胞活力实验、细胞凋亡实验及光热治疗实验。3. 2021年7月-2022年1月：通过体内动物实脸，完成Tf/TAT-1CG-M13-LP对荷瘤小鼠的活体组织分布实验、在荷瘤小鼠中体内的药代动力学测定和各组织的定量分布测定实验。通过体内动物实验，完成Tf/TAT-1CG-M13-LP对荷瘤小鼠联合治疗效果的评价实验。4.2022年1月-2022年6月：参加国际/国内组织的重要学术交流活动1-2次。撰写文章并投稿，结题。(七)已有基础1 .与本项目有关的研究积累和已取得的成绩(1)前期理论基础团队成员查阅大量相关国内外文献资料，学习了免疫学、生物化学、病理生理学等课
42、程，掌握分子生物学、细胞生物学等实脸操作技术。熟练掌握肿瘤细胞培养、细胞移植技术及分子生物学、细胞生物学实验手段。指导教师从事科研工作以来，先后参与福建省自然科学基金面上项目、福建省自然科学基金重点项目以及科技部重大科学问题目标导向项目，积累了较好的课题基金的组织实施经验。导师组对双配体修饰的双载药脂质体Tf/TAT-PTX/DOX-LP的制备工艺及在脑肿瘤及恶性肿瘤系统的应用做了大量研究，积累了较丰富的经脸。导师组已经发表文章3篇相关SCl文章；积累了相关学术和技术基础。并且成功合成了27种哌嗪类苦参碱衍生物，其中包括本项目所选用的哌嗪类苦参碱衍生物MI3。(2)双配体修饰的双载药脂质体Tf
43、TAT-PTXDoX-LP的制备工艺及在脑肿瘤系统的应用首先成功合成功能性材料DSPE-PEG35Oo-MaI和DSPE-PEG10qo-TATo功能性材料DSPE-PEG350O-MaI和DSPE-PEGn)O(TTAT,DSPE-PEG喉-MaI(产率为91.4%)和DSPE-PEG35w-MaI(产率为80.7%)oDSPE-PEG以O-Mal的化学结构经TOFMSES+验证(MWcacuIated=4304Da,Mwobserved=4300Da)oDSPE-PEGlOOO-TAT,产率为85%oDspe-PEG1OOO-TAT的化学结构经TOFMSES+脸证(MWcacuIated=
44、3820Da,Mwobserved=3840Da)。图2.DSPE-PEG-TAT的合成示意图采用薄膜分散-硫酸锭梯度法制备脂质体，通过有机相反应法和插入法，成功的将TAT和Tf共修饰在脂质体的表面。图3.Tf/TAT-PTX/DOX-LP的粒径分布(A)、在透射电镜下形态照片(B)、在50%胎牛血清中的粒径变化(C)和浊度变化(D)、37C脂质体中PTX(E)和DoX(F)的药物释放。图3显示制备的Tf/TAT-PTX/DOX-LP形态多为规则的类球形，DOX包封率为91.821.44%,PTX包封率为81.352.09%,粒径为124.56.4nm,PDI为0.2440.027,Zeta电
45、位为-5.190.45mV,DOX和PTX载药量分别为6.170.19%和2.710.08%,在37C、50*血清放置24h稳定，并可在4C储存14天，满足体内外评价的要求。另外体外红细胞溶血实验证明脂质材料的血液相容性较好。图4.采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪测定不同脂质体在C6、bEnd.3细胞中的定性和定量摄取。图4综合C6和bEnd.3摄取实验的定量测定和定性观察，结果均表明Tf/TAT-DOX-LP摄取能力明显强于TAT-DOX-LP和Tf-DOX-LP,体现了双配体修饰脂质体中，配体之间的协同介导脂质体入胞的作用。图5.不同脂质体在肿瘤球中的定性（A）和定量（B）摄取图5表明，在
46、Tf和TAT的协同作用下Tf/TAT-DOX-LP的肿瘤球穿透性最强，其次是TAT-DOX-LP、Tf-DOX-LP.PEG-DOX-LP,说明在肿瘤球三维结构中Tf/TAT-DOXTP具有较强的协同穿透肿瘤入胞效果。各组脂质体在三维肿瘤球的穿透性结果与单层细胞的摄取结果一致。图6.脂质体在C6细胞中的凋亡实验图7.脂质体在C6细胞中的凋亡实验图6和图7证明，无论是双配体修饰的脂质体，单配体修饰的脂质体还是普通长循环脂质体，PTX和DOX两种药物联合应用，与单用PTX或者DoX相比，能使更多的肿瘤细胞凋亡，表现出了良好的抗肿瘤效果。还说明了无论是单用PTX或者DOX,还是PTX和DOX联合应用
47、，双配体修饰的脂质体比单配体修饰的脂质体有更明显的促进肿瘤细胞凋亡，表现了Tf和TAT具有良好的协同作用。其中Tf/TAT-PTX/DOX-LP组的促C6细胞凋亡的能力最强，凋亡和坏死细胞占中细胞数的86.7%o图8(A)证明不同脂质体在荷C6瘤小鼠脑内的分布差异较大。无论是哪个时间点，Tf/TAT-DIR-LP在脑肿瘤处的蓄积明显高于Tf-DIR-LP.TAT-DIR-LP和PEG-DIR-LP0在给药Ih时，各组脂质体在荷C6瘤小鼠脑内的分布最强，随着给药时间的增加，各个组脂质体在荷C6瘤小鼠脑内的分布逐渐减弱。图8(B)证明各脂质体在小鼠C6脑胶质瘤中蓄积的顺序为：Tf/TAT-DIR-LPTf-DIR-LPTAT-DIR-LPPEG-DIR-LP,该结果与活体成像结果一致。通过小鼠脑的离体结果，可以明显看到给药后1h,各组脂质体在荷C6瘤小鼠脑内的分布最强，随着给药时间的增加，各个组脂质体在荷C6瘤小鼠脑内的分布逐渐减弱。另外，Tf-DIR-LP在脑肿瘤处的蓄积高于TAT-DIR-LP,且可以清楚看到PEG-DIR-LP在脑内有蓄积。Tf和TAT双配体脂质体在脑肿瘤处的蓄积明显高于单配体修饰的脂质体和PEG脂质体，表明Tf/TAT-DIR-LP既保留了Tf的特异性，又具有TA
