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1、快速序列测定：双脱氧末端终止法摘 要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等1977年提出的双脱氧链终止法与Maxam和Gilbert1977年提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等1977提出的酶法双脱氧链终止法和Maxam1977提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的假如干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种或多种特定的残基，形成一系列以某一
2、特定核苷酸为末端的长度各不一样的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要根底，可别离仅差一个核苷酸、长度达300500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了根底，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序
3、方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法sequencing by hybridization，SBH等。双脱氧末端终止法测序一、 原理 双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的根底上开展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原如此将脱氧核苷三磷酸dNTP底物的5-磷酸基团与引物的3-OH末端生成3,5-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从53延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸ddTNP作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3位置缺少一个羟基2,3-ddNTP图7-4
4、-1，可以通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3-OH，不能同后续的dNTP形成3,5-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反响体系中，在4种dNTP混合底物中分别参加4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。图7-4
5、-1脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构5GAGTCACACTTGAC 3待测单链DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddGTP反响3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG 5加ddCTP反响3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG 5加ddTTP反响3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG 5加ddATP反响3ACTG 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5变性凝胶电泳、放射自显影5 ACTGGAGTCACACTT测序图谱识读3 图7-
6、4-2双脱氧链终止法测序原理二、Sanger法DNA测序的试剂一模板 有两种类型的DNA模板可以作为Sanger法测序的模板，即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。1单链DNA模板：在一般情况下，可将靶DNA片段克隆于M13mp载体，从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中别离得到的单链DNA模板。这种单链模板效果最优，只要细心掌握模板与引物的最优比例，有经验的测序人员通过一次末端终止反响，能读取500个以上的核苷酸序列。2经热变性或碱变性的双链DNA模板：尽管采用变性双链DNA作测序模板显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。利用双链质粒模板测序，其中有两个至关重要的
7、因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反响亦可能读出300核苷酸序列。应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配套的通用引物结合区。最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列与Bluescript系列等。双链模板测序最大的优势是对序列DNA的亚克隆进展鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板过程。二引物 酶促测序反响中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在
8、许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。但也可以采用Sanger 法商定变性双链DNA模板的序列。在以上两种情况下， 都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。适于M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15-29 个核苷酸，并可与紧靠M13mp18噬菌体多克隆位点区的Hind位点成M13mp19 噬菌体多克隆位点区的EcoRI位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进展“双链测序，并可从许多厂商中购置得到。此外，还有假如干家公司出售一些引物，这些引物下为了对通过多种限
9、制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进展测序而设计的。三DNA聚合酶 如前所述，选用适宜的DNA聚合酶进展测序反响也是保证测序质量的重要因素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：其中包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段Sanger等，1977，反转录酶见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987经过修饰消除了35外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶Sequenase和测序酶2.0，Tabor和Richardson，1978惟与从嗜热水生菌Thermus aquaticus别离的耐热DNA聚合物Taq DNA聚合酶。这些酶的特性差异悬殊，因而可大大影响通过链终止反响所
10、获得的DNA序列的数量的质量。1大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段：这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶。 通常碰到的两个问题是：1Koenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进展长中距离移动，因此利用该酶进展的标准测序反响所得序列的长度有限。通常，这一反响只能得到大约250-350个核苷酸的序列。 如果分两步进展反响，所得序列的数目可以翻一番；其中第一步是初始标记步骤，采用低浓度的dNTP，而随后的第二步是链延伸链终止反响，含有ddNTP
11、和高浓度的dNTPJohoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988。然而即使有了这些改良，用Klenow 酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。2这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含结实二级结构的区域进展复制的效能很低。将聚合反响的温度提高到55，可以缓解但并不能彻底解决这一问题Gomer和Firtel，1985)。有时可采用一些dNTP类似物如dITP或7脱氮dGTP7deaza-dGTP来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息，但Kleow酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使Klenow酶原已较低的持续合成能
12、力进一步降低。总而言这，可以选用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段测定从引物5位置起250个碱基以内的一段DNA序列， 但不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和或同聚核苷酸段的DNA序列。2反转录酶：尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一看来要比Klenow酶略胜一筹Karanthaansis，1982;Graham等,1986 ,尽管它们也许还是比测序酶逊色Cameron-Mills，1988;Revak等1988。3测序酶：测序酶SequenaseTM是
13、一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。这酶原来具有很强的35外切核酸活性，经过修饰后， 这一活性大局部均被消除。测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了3 5外切核酸酶活性，极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7脱氮dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反响常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。为了充分利
14、用测序酶极高的持续合成能力，可采用两步测序反响。第一步首先采用低浓度的dNTP的较低温度， 以便将合成反响限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反响限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反响的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。 再将第一步反响等分于4组1套的标准反响系统中，每组反响中都含有高浓度的d NTP和一种ddNTP。这样聚合反响就得以继续，直至造成链终止的核革酸掺入正在增长的链中。4Taq DNA聚合酶：适用于测定在37 形成大段稳定十级结构的单链DNA模板序列。这是因为Taq DNA聚合酶在70-75活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无
15、法形成二级结构。按照1nnis 等1988介绍的方法使用Taq DNA聚合酶进展测序，在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰如一，明确这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反响与普通PCR反响有所不同。只需一条引物，通过单引物进展热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反响底物除四种脱氧核苷三磷酸dNTP外，还参加了双脱氧核苷三磷酸ddNTP，进展扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一
16、系列不同长度的扩增片段。四放射性标记的dNTP传统的DNA测序方法都采用-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反响后24h内进展电泳，否如此无法获得好的结果。近年来-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的射线，克制了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反响产物可在-20保存一周，而分辨率并不下降。五dNTP类似物二重对称的DNA区段特别是GC含量高者可以形成链内二级过程中不能充分变性。
17、因此将引起不规如此迁移，使邻近的DNA条带压缩在一起，以致难以读出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构的存在，而且不可能通过改变测序反响中出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构地存在，而且不可能通过改变测序反响中所用DNA聚合酶的种类而得到减轻。但是凝胶中的压缩区段往往可以通过采用诸如dITP2脱氧次黄苷15 三磷酸或7脱氮dGTP7脱氮2脱氧鸟苷5 三磷酸等核苷酸类似物进展分辨。这些类似物与普通碱基的配对能力较弱，而且是测序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的适宜底物Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988。但对某些压缩条带，7脱氮dG
18、TP无济于事；同样，dITP也无补于另一压缩条带尤其是得于GC丰富区的缩条带的分辨。如果需要采用类似物，首先可试用dOTP，如果压缩条带用d ITP或7脱氮dGTP都无法分辨， 如此转而测定另一条链的DNA序列几乎总能如愿以偿。如上所述，两种形式的测序酶和Taq DNA聚合酶对核苷酸类似物的耐受性优于大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造厂商声称在测定含稳固二结构的模板序列时，测序酶2.0版要优于原来的测序酶。测序酶2.0版持续合成能力强于测序酶，其作用总是一气呵成，很少半途而废，因而消除了“鬼带。 而且，测序酶2.0版对诸如dITP类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。六
19、关于DNA序列的识读DNA序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反响位置；识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸如TTTTT、AAAAA或交替出现的嘌呤和嘧啶如GTGTGTGT，一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。三、双脱氧链止终法测定战略由于DNA一般都由几千个单核苷组成。而目前测定DNA序列的最好方法，一次也只能测约600个核苷酸，因此进展DNA顺序测定前，需要用不同限制酶消化等测DNA，使其降成小片段，分别克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等载体中，分别测
20、定各小片段的顺序，由于不同限制酶产生的片段之间有交织重叠顺序，根据片段间和末端重叠序列，用计算机软件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，进而排出DNA的全序列。四、双脱氧链终止法测定方法以M13噬菌体为载体的双氧链终止法的实施步骤为例：1M13噬菌体复制型双链DNARFDNA的制备。为了将待测双链DNA进展克隆，必须制备M13mp18或M13mp19复制型闭环双链DNA，从M9培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌，JM101到50ml2YT培养基中，37振荡过夜。稀释1ml培养物到50ml2YT培养中，于37振摇6h，转移2ml培养物于微量
21、离心管中，12000g，离心5min细菌沉淀保存用于别离复制型RFDNA，上清用于别离噬菌体单链DNA。细菌沉淀用于别离复制型DNA，可以采用标准的碱解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA试剂盒制备。方法同别离质粒DNA方法。2重组噬菌体制备采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNA，并采用一样内切酶切割M13噬菌体RFDNA采用Biol 101gene clean 试剂盒分别纯化内切酶切割后的DNA片段，然后将待测外源DNA片段与M13复制型载体DNA连接过夜，连接反响物转染JM101感受态细菌，将连接物10l与200l感受态细菌混匀，放置冰上4050min，再放在
22、42水浴2min，然后参加1ml新鲜的静止相JM101培养物混匀，然后分别以300l于含有IPIG200mg/ml和X-gal200mg/ml的2YT培养基上，于37培养8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌噬斑，即为阳性重组噬菌体。3单链噬菌体DNA模板DNA的制备上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNA分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进展培养便可得到一种单链形式的DNA。为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的OD600=0.1的大肠杆菌JM101培养物中，于37振摇5h左右，12000g离心10min，上清转移到另一新微量离心管中用于别离单链DNA，按1ml上清液
23、中参加含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl 200g/l，也可采用天美公司的Wizard TM M13DNA纯化试剂盒别离纯化M13单链DNA。4引物制备可以购置通用引物或实验室合成15bp26bp长度的引物，通常以2g/ml的浓度贮存于-20备用。5微量滴板进展大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管中进展与引物的退火反响，然后在微量滴板中进展链延伸-链终止反响。6变性聚丙烯酰胺凝胶测序凝胶装置的大小形状均不一样，其主要参数有：长度通常为4050cm；宽度通常为20cm；厚度通常为0.30.4mm；横截面形状为楔形或锥形，即顶部薄，底部厚，或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提高；加样槽；整块凝胶上的温度应均一。7电泳后将凝胶枯燥，放射自显影。8凝胶上读取DNA序列。此时读取的是目的DNA的互补链35的序列。参考文献：1 王曼莹主编.分子生物学.：科学，20062 裴黎.现代DNA分析技术理论与方法.：中国人民公安大学，20023 赵亚华.生物化学与分子生物学实验技术教程.：高等教育，20054 杨岐生.分子生物学.某某：某某大学，20055 梁国栋.最新分子生物学实验技术.:科学，2001
