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1、化学发光与电致化学发光,化学发光,一、化学发光现象,萤火虫发光,生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。,1877年 洛粉碱CL1905年 洛粉碱类似物1928年 鲁米诺1935年 光泽精1960s PMT 出现 发现许多有机反应可产生CL,所谓化学发光(CL),就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。,化学发光反应能级图,直接化学发光A+B C*+DC*C+h例:NO+O3 NO2*+O2 NO2*NO2+h,二、化学发光反应的分类,间接化学反应发光 A+B C*+D C*+E E*+C E*E
2、+h,例:,三、化学发光反应发生的条件,化学反应是放热反应。化学反应的自由能的变化与发光波长的关系:G hc/ex 2.857 10 4 千卡/ex 摩尔 400750nm的可见光发射时所需要的G 的数值应在3871千卡之间。必须存在形成电子激发态的通道。激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态,或将能量传递给荧光分子。,四、化学发光反应的机理,激发态氧生成型 H2O2+Cl22 HCl+O2*O2*O2+h 低浓度 单分子发射 1268nm 高浓度 双分子发射 634nm 分子对同时跃迁,双氧基化合物分解 最有效的化学发光反应与双氧基化合物的分解有关。,基态h,电子转移反应,e-,中性分子,自
3、由基阴离子,氧化剂,+,+,受激分子,还原了的氧化剂,自由基阴离子与氧化剂之间的电子转移,自由基阳离子与还原剂之间的电子转移,h,五、化学发光反应,无机物的化学发光 一些无机物能够产生很弱的化学发光，例如：硫酸氢盐被铬酸氧化水被K、Na、Mg、汞齐分解Al被空气中氧氧化强酸被强碱中和亚硫酸钠被空气氧化,有机物的化学发光烃醇、醛、酮、酸、酯多酚杂环化合物,典型的化学发光反应,鲁米诺(luminol),3-APA,max=425 nm氧化剂:H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂:过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Co2+、Cu2+、Fe3+etc.),光泽精(
4、lucigenin),max=440 nm(绿色)氧化剂:H2O2 还原剂+O2 还原剂:乳酸 尿酸 抗坏血酸催化剂:过渡金属离子抑制剂:酚类物质对此反应有抑制作用,过氧化草酸酯(peroxyoxalates),氧化剂:H2O2此反应本身能产生弱的化学发光.max=440 nm,550nm.,邻菲罗林(1,10-phenanthroline),氧化剂:H2O2 催化剂:Cu2+Co2+Pb2+Fe3+Ni2+抑制剂:蛋白质与Cu2+形成络合物,萤火虫发光(firefly BL),max=562 nm,此反应重要的分析对象是ATP 10-1110-14mol,细菌发光(bacterial BL)
5、,还原型吡啶核苷酸黄素,主要分析物 FMN 10-12mol此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15mol,max=490nm,六、化学发光的表征,动力学曲线（反应时间）光谱量子产率化学发光强度,七、化学发光分析,使R过量,kA,CA(t)=CA0 e-ktIc L(t)=cl=cl kCA(t)=cl k CA0 e-k t,尽管A物质的 CA0 各不相同,但 I 达到 Imax的时间相同.e-kt为常数.Icl(t)CA0 定量分析的依据,利用发光反应动力学曲线对催化物质的分析,以测定时间为基础的发光分析,当反应进行到t时，如反应消耗了x mol的R和A，则也生成了x mol的B,
6、反应物质浓度减少一半所需的时间,缺点：样品中被测物质浓度未知，故唯以使反应物起始浓度相等。只可用多次测定法逐步得到准确值。,八、化学发光的探测,分立式进样化学发光仪,R1,R2,s,这类仪器适合于选择性好,量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。不适用于快速化学发光反应(15S)的重现性监测。,流动注射进样化学发光仪,样品sample,waste,PMT,recorder,蠕动泵,流通池(flow cell),九、化学发光分析的特点,优点:灵敏度高,线形范围宽；仪器简单,价格便宜；分析时间短。缺点:选择性差。,电致化学发光,一、电致化学发光现象 电致化学发光(ECL)是通过在电极上施加一
7、定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。,二、典型的电致化学发光反应.多环芳烃的ECL 按激发态分子或离子产生的历程可分为两类:通过单重激发态途径的ECL(S-route ECL)R-e R.+电极氧化 R+e R.-电极还原 R.+R.-R+1R*自由基湮灭 1R*R+h 发光过程 9,10-二苯基蒽,将200Hz 左右的方波电位(1.3-2.2V vs.SCE)加到电极 DPA-e DPA.+1.3 V DPA+e DPA.-2.2 V DPA.+DPA.-1DPA*+DPA 1DPA*DPA+h(=512nm),通过三重态途径的ECL(T-r
8、oute ECL)R-e R.+电极氧化 R+e R.-电极还原 R.+R.-3R*+R 自由基湮灭 3R*+3R*1R*+R 激发态转化 1R*R+h 发光过程 N,N,N,N-四甲基苯二胺(简称TMPD)和DPA 的混合溶液中,TMPD e TMPD.+0.16 V DPA+e DPA.-2.1 V DPA.-+TMPD.+3DPA*+TMPD 3DPA*+3DPA*1DPA*+DPA 1DPA*DPA+h,鲁米诺的ECL,on a rotating ring(Au)-disc electrode(Au)system disc:OOH negative pulse ring:OOH O2
9、positive pulse LH L,鲁米诺的典型ECL 反应机理,Ru(bpy)32+的ECL Ru(bpy)32+e Ru(bpy)3+电极还原 Ru(bpy)3 2+-e Ru(bpy)33+电极氧化 Ru(bpy)3+Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+h(=620nm),当体系中含有强氧化或还原性物质,只要施加单向正或负电压就可以得到Ru(bpy)32+的ECL。如典型的Ru(bpy)32+-C2O42-和Ru(bpy)32+-S2O82-体系：,Ru(bpy)32+-C2O42-共存体系的ECL 机理,Ru(bp
10、y)32+-S2O82-体系的发光反应机理:Ru(bpy)32+e Ru(bpy)3+S2O82-+e SO42-+SO4.-SO4.-+Ru(bpy)3+Ru(bpy)32+*+SO42-SO4.-+Ru(bpy)32+Ru(bpy)33+SO42-Ru(bpy)3+Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+h,三、电致化学发光仪,四、电致化学发光的特点,灵敏度高,线性范围宽,仪器简单。化学发光反应的电化学诱发可对这些反应在时间上进 行控制。可通过变换电位控制反应,改善选择性。光产生于电极附近,改善了分析探测的空间控制。试剂可现场
11、产生，不稳定分析物可现场产生。没有电化学探测中的电子干扰问题。多种物质可被同时测定。一些化合物可在ECL反应中被循环使用。电极表面的污染问题。ECL体系较少,分析物种有限。机理问题。,分析化学应用一、流动注射化学发光分析 Hua Cui,Shifeng Li,Xiangqin Lin Chemiluminescence of Ce(IV)and surfactant Tween 20Analyst,2001,126,553 Hua Cui,Shifeng Li,Feng Li,Yugang Sun,Xiangqin Lin A novel chemiluminescent method for
12、 determination of salicylic acid in bactericidal solutionsAnalytical and Bioanalytical Chemistry,2002，372，601,A novel method for determination of salicylic acid by use of Ce(IV)-Tween 20 chemiluminescence reaction,Hua Cui,Shifeng Li,Feng Li,Yugang Sun,Xiangqin LinDepartment of Chemistry,University o
13、f Science&Technology of China,Hefei,Anhui 230026,P.R.China,Ce(IV)+Tween 20+H+CL salicylic acid enhanced the CL,Fig.1 Chemiluminescence spectra(a)Ce4+Tween 20;(b)Ce4+Tween 20+salicylic acid max=478 nm,Fig.2 Kinetic Curves Tween 20:8%(v/v)SA:4.010-7 g/mL Ce4+:810-5 mol/L(0.1 mol/L H2SO4)(a):Ce4+Tween
14、20(b):Ce4+Tween 20+salicylic acid,Flow injection system,Fig.3,Working curve and detection limit,Regression equation lgI 6.65 0.75lgc(r0.9983)Linear range 410-9 1.110-6 g/ml Detection limit 2.510-9 g/ml(S/N3)Standard deviation:0.85%(n=11),Application,*Ref:UV-Spectrophotometry,Table 3 The determinatio
15、n of salicylic acid(SA)in bactericidal solution(n6),CL mechanism,Who is the emitter?Reduction product of Cerium(IV)?Cerium(III),which is formed by the reduction of cerium(IV),is a well known fluorescent ion and therefore is a possible CL emitter.Cerium(III)em=355 nmCL reaction=478 nmCerium(III)is un
16、likely to be the emitter,Oxidation product of Tween 20?It is postulated that an oxidation product of Tween 20 is an emitter.If the oxidation product is stable,it should be detectable at 478 nm in fluorescent spectra of the CL reaction mixture.However,no peak was observed at 478 nm in the fluorescent
17、 spectra.The result indicated that the emitter may be involved in the subsequent reactions or other species may be the emitter.,Other species?Tween 20 molecules contain several hydroxy group.The oxidation of some polyhydric phenols such as pyrogallol and gallic acid with molecular O2 or H2O2 in alka
18、line medium were reported to give weak CL.Emission spectra show two peaks with maxima at 475-505 nm and 635 nm.A CL mechanism involving emission from singlet oxygen and intermolecular energy transfer has been proposed:,(O2(1g)2 2O2(3g-)+h=643 nmO2(1g)O2(1g-)2O2(3g-)+h=478 nmO2(1g)O2(1g+)+P0 2O2(3g-)
19、+1P*P*P+h=475-505 nm,Therefore,it is likely that the CL reaction formed singlet oxygen 1O2*and the emission was from excited oxygen molecular pairs O2(1g)O2(1g-).,Pathways The formation of singlet oxygen 1O2*in this reaction may be from three possible routes:Ce4+Tween 20 Ce3+X X 1O2*+X(1)1O2*3O2+h X
20、+O2dis(O2_X)1O2*+X(2)1O2*3O2+h X+O2dis(1O2-X)*3O2+X+h(3),Analytical potential,For the determination of SA,the interferences from some polyphenols were observed.Is it possible to use the CL reaction for the detection of other compounds?The Effects of some polyphenols and anilines on the CL reaction w
21、ere examined.,Table 4 The effect of some polyphenols and anilines,Table 5 Parameters of regression equations and detection limits for polyphenols,二.HPLC-CL联用技术,Ce4+体系的高效液相色谱-化学发光检测法,混合样品浓度:2.510-6g/ml.Ce(SO4)2 810-5mol/l(0.075mol/l H2SO4流动相 CH3OH:H2O:CH3COOH 流速 1.0 ml/min 吐温-20 9%,三、化学发光免疫分析,竞争法：（检查
22、小分子抗原多采用）启动发光试剂 Ag+Ag-L+AbAg-Ab+Ab-Ag-Lh,夹心法：（检查大分子抗原多采用）启动发光试剂(Sp-Ab+AgSp-Ab-Ag)Sp-Ab-Ag+Ab-LSp-Ab-Ag-Abhv其中:L为发光标记物或发光底物,Ag为抗原,Ab为抗体,Sp为固相。,化学发光免疫技术具有灵敏度高、所需时间短、无放射性污染等优点，现已进入常规临床诊断应用。目前，已有甲状腺功能、生殖生理、肿瘤标志物、药物检测及心血管等四十个检测项目可供临床应用。,四.电致化学发光生物传感器,葡萄糖传感器,GDH,GDH-glucose dedydrogenas,Ru(bpy)32+Ru(bpy)33+e,Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+h,Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+*,reductant,电极:WE:Pt RE:Ag/AgCl CE:stainless-steel,电极制作,Enzyme immobilization,Pore glass(CPG),CPG,aminoalkylsilane,glularaldehyde,GDH0.1M PBS,Thank you!,
