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1、植物生理学实验,植物学实验室-实验规则和注意事项,1每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。2上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定座位入座。3实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时向教师报告，自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许，不能动用实验室其它非本次实验所用的仪器设备。4实验时要遵守纪律。严禁彼此谈笑喧哗，不准在实验室吃食和会客。不准在实验室打手机，发送短信。,5实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。使用显微镜检查非永久片时，要特别小心。防止
2、染料或试剂沾污镜头和镜台，不要用高级显微镜观察非永久片。操作要正规，观察要认真仔细，及时完成实验报告。6要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂和溶液瓶上，必须贴上标签，注明名称、成份、浓度、配制日期。7实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在废物缸内，不能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。,实验一：植物组织渗透势的测定（质壁分离法）,实验目的观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程，了解
3、其用于测定植物组织渗透势的原理与方法。,实验基本原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。这种渗透势相等的溶液称为等渗溶液。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的最低浓度和尚不能引起质壁分离的最高浓度之间的溶液浓度。代入公式即可计算出其渗透势。,实验用品1材料：洋葱鳞茎2器材和仪器：显微镜、载玻片及盖玻片、镊子、刀片3试剂：100mL浓度1 mol/L蔗糖溶液用蒸馏水配置0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60mol/
4、L蔗糖梯度溶液各5mL,方法步骤,1、取带洋葱鳞茎下表皮（用单面刀片划约5 mm*5 mm方块用镊子将其取下），迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中使其完全浸入，约20-30min。2、从0.60 mol/L蔗糖溶液开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于10倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片做同样观察，并记录质壁分离的相对程度。,3、确定引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。4、在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至把握准确为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓
5、度之平均值的渗透势相等。,5、将结果记录到下表1-1中。,测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不引起质壁分离的最高浓度平均值之后，代入下列公式，-s=RTiC1计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。其中：-s为细胞渗透势；R为气体常数0.083*105 LPa/molK；T为热力学温度，单位K；即273t，t为实验温度，单位是；i为解离系数，蔗糖为1；C1为等渗溶液的质量摩尔浓度，单位是mol/L则-s=0.083*105*（273t）*1*C1,注意事项,1、撕下的表皮组织必须完全浸没在溶液里2、使用高倍物镜时，禁止用粗调焦螺旋。,思考题,如何提高质壁分离法测定植物组织渗透势实验的准确性
6、,实验作业,绘图植物细胞质壁分离现象计算植物组织渗透势实验报告,实验二 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定,目的要求初步掌握提取叶绿体色素的正确方法，理解分离叶绿体色素的原理。了解叶绿体色素的光学特性在光合作用中的意义。,植物所呈现的颜色主要是由脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞液色素（主要是花青素）所致。花青素普遍存在于花卉中，其色泽随细胞液中酸碱度不同而改变，植物色素在植物中分布广泛。叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜蛋白结合成色素蛋白复合体而存在。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可用丙酮、乙醇等有机溶剂将它
7、们从叶片中提取出来。因为它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。,实验基本原理,花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。颜色受多因素影响：B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红芳香酸对主要骨架的酯化液泡中pH值 酸红碱蓝营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累,不同花色素的取代基和颜色,花色素 3 4 5 颜色花葵素-H-OH-H 橙红 花青素-
8、OH-OH-H 紫红花翠素-OH-OH-OH 蓝紫芍药素-OCH3-OH-H 玫瑰红甲花翠素-OCH3-OH-OH 紫二甲花翠素-OCH3-OH-OCH3 紫红,叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快；叶绿素中的镁可被H+取代而生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。,实验用品,1材料：植物叶片2器材和仪器：大试管、天平、研钵、量筒、移液管、烧杯、漏斗、毛细管、剪刀、滴管、滤纸。3试剂：丙酮、醋酸铜、6N盐酸、30%氢氧化钾甲醇溶液、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、石油醚。,方法步骤,1 叶绿体色素的
9、提取和分离称取新鲜叶片2克，放入研钵中加丙酮5毫升（分批，即少量多次），少许石英砂，研成匀浆，再加丙酮10毫升，以漏斗过滤（最好用脱脂棉）即为色素提取液。定量至20mL，放于暗处备用。把展层用的滤纸剪成2cm10cm的纸条，将一端剪去两侧，中间留一长约1.5 cm的窄条。用毛细管吸取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不易过多，风干后再点，这样重复点几次，使展层效果好一些。,在大试管（染色缸）中加四氯化碳3-5 ml及少许无水硫酸钠。将滤纸条固定在软木塞（玻璃盖）上，插入试管内，使窄条浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），直立于阴暗处进行层析。待溶剂前沿达滤纸条上沿
10、0.5-1.0 cm时，取出滤纸条，立刻用铅笔在溶剂前沿划线作记号。最前端橙黄色的是胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。,2叶绿体色素的理化性质叶绿素的荧光现象：取上述色素丙酮提取液少许于试管中，分别观察在反射光和透射光一侧，提取液的颜色有无不同。光对叶绿素的破坏作用：取上述色素丙酮提取液少许分装于2支试管中，1支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹），另一支试管放在强光下，经2-3小时后，观察两支试管中溶液颜色有何不同。,铜代反应：取上述色素丙酮提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许
11、，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色，此即形成铜代叶绿素。,黄色素与绿色素的分离（皂化反应）取上述色素丙酮提取液10mL，加到盛有20mL乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30mL 蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚层1-2次。然后于色素乙醚溶液中加入5mL30%KOH甲醇溶液（皂化反应），用力摇动分液漏斗，静止10min，再加蒸馏水约10mL，摇动后静止分离，则得到黄色素层和绿色色素层，分别保存于试管中。,实验结果,1在层析纸上标出各个条带分别是什么色素。2记录叶绿素在反射光和透射光下的颜色3.记录光
12、对叶绿素的破坏作用及铜代反应的结果 4.记录皂化反应的结果,注意事项,1为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。2研磨时间尽可能短些，以不超过5分钟为宜。并将叶片中色素浸提干净。丙酮，乙醚等试剂易着火，远离火源,思考题,1.研磨提取叶绿素时加入CaCO3有什么作用？加多了会出现什么问题？2叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的分子量有关吗？3.铜在叶绿素中取代镁的作用，有何实用意义？,思考题,4 叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量来源有何差异？5 转GFP的植物在检测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标
13、记绿色植物细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?6 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？,实验作业,完成实验报告复习叶绿素的有关理化性质,皂化反应,皂化反应是碱催化下的酯水解反应，尤指油脂的水解。狭义的讲，皂化反应仅限于油脂与氢氧化钠混合，得到高级脂肪酸的钠盐和甘油的反应(还有部分水）。这个反应是制造肥皂流程中的一步，因此而得名。,皂化反应:Chla、Chlb 是双羧酸的酯 一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应 另一个羧基被叶醇基酯化 COOCH3 C32H30ON4Mg+2KOH COOC20H39 COOK C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OH COO
14、K 取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色,实验三 叶绿素a、b含量测定,目的要求,熟悉分光光度法测定物质浓度的原理 掌握在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。,基本原理,根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。,各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数（）可通过测定已知浓
15、度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。,欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b的含量，只需测定该提取液在两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。,Arnon公式,叶绿素a的最大吸收峰在663 nm，叶绿素b的最大吸收峰在645 nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据LambertBeer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之
16、间有如下关系：Ca12.7OD6632.69OD645Cb22.9OD6454.68OD663CTCaCb其中Ca、Cb和CT分别为叶绿素a的浓度、叶绿素b的浓度和叶绿素的总浓度，单位为mg/L,实验用品,材料：植物叶片器材和仪器：722型分光光度计、研钵、剪刀、玻棒、10 mL 容量瓶、小漏斗、滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管、电子天平 试剂：80 丙酮、石英砂。,方法步骤,1.色素提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉称取0.5 g放于研钵中加2 ml 丙酮、少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，加入80丙酮4 mL过滤后，再用4 mL 80丙酮冲洗，并用80丙酮定容至10 mL。2.测定吸光值 取上述色素
17、提取液1mL，加80丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80丙酮为对照，分别测定663 nm、645 nm处的吸光值。,3.计算叶绿素含量带入公式计算叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a和b的总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。（g/gFW）,实验结果,1记录样品663 nm、645 nm处的吸光值2计算样品中叶绿素a、b与总叶绿素浓度,注意事项,1.为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。2.叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长下测量吸光值，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时吸光值的 5，否则应重新过滤。,思考题,叶绿素 a、
18、b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a、b 的定量分析?为什么?为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？,Arnon公式推导,已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：D663=82.04Ca+9.27Cb（1）D645=16.75Ca+45.60Cb（2）式（1）、（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645
19、nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。解方程组（1）、（2），得：Ca=12.72D663 2.59D645（3）Cb=22.88D645 4.67D663（4）将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）：CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663（5）,在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：Ca=12.21D663 2.81D646（7）Cb=20.13D646 5.03D663（8）Ccar=（1000D470 3.
20、27Ca 104Cb）/229（9）式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Ccar为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：Ca=13.95D665 6.88D649（10）Cb=24.96D649 7.32D665（11）Ccar=（1000D470 2.05Ca 114.8Cb）/245（12）
21、,实验四 植物组织中可溶性糖含量的测定,目的要求,掌握植物组织中可溶性糖的测定原理与方法。了解不同植物组织中可溶性糖含量的变化,基本原理,植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，颜色的深浅与糖的含量成正比，在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比，故可用于糖的定量测定。由于蒽酮试剂与糖反应的显色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。该法简便但没有专一性，绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮试剂反应产生颜色，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶
22、性碳水化合物总量。,实验用品,1材料：各种植物叶片或种子。2器材和仪器：实验仪器 722s型分光光度计或其它型号、恒温水浴、烘箱、电子天平、研钵。3试剂：80酒精、葡萄糖标准液、蒽酮试剂。,方法步骤,可溶性糖的提取：植物叶片于110烘箱烘15分钟，然后调至70过夜。称取磨碎的干叶片50 mg（0.05g）倒入试管中，加6 ml 80的酒精，置于80水浴中温浴40分钟，过滤。滤渣加2 mL 80的酒精重复提取两次，过滤。,-滤液加0.02 g活性炭，于80水浴中脱色30 min，过滤，定容到15 mL的容量瓶中，静止10 min。显色及比色：-取0.5 mL上清夜，加入4.5 mL蒽酮试剂混合，
23、摇匀,沸水浴煮10分钟，冷却后在625 nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。附注:包菜取上清夜0.1 mL,加 4.9 mL蒽酮试剂混合,摇匀.,绘制标准曲线-取标准葡萄糖溶液0、5、10、20、40、60、80、100 g/mL的不同浓度的溶液各0.5 mL加入4.5 mL蒽酮试剂,摇匀,沸水浴煮10分钟，冷却后在625 nm处测OD值。,实验结果,1绘制葡萄糖标准曲线。2计算可溶性糖的含量。,公式中：C 从标准曲线查得葡萄糖浓度，g/mL。V T 样品提取液总体积，mL。V 1 显色时取样品液量，mL。W 样品干重（g）。,注意事项,脱色的时候一定要混匀，是石炭粉与提取液充分
24、混合。蒽酮试剂含有浓硫酸，使用时应该小心,思考题,应用蒽酮比色法测得的糖包括那些类型？你知道还有那些方法可以测定可溶性糖类？,实验作业,苯酚法测定可溶性糖,【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485 nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。,实验五 过氧化物酶活性
25、的测定（分光光度法）,目的要求,学习和掌握比色法测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的原理和方法。,基本原理,过氧化物酶（Peroxidase，POD），是一族能够利用H202氧化供氢体的酶。它对H2O2的需求是非常专一的，而对供氢体的要求则较为广泛。酚类、胺类化合物、某些杂环化合物和一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢体。它们的催化反应式为：AH2H202 A2H2O式中AH2,为供氢休，A为氧化型产物，E为过氧化物酶。,E,过氧化物酶(E.C.1.11.1.7)是一类氧化还原酶。是由一个糖蛋白和一个氯正铁血红素IX(Protohemin IX）的铁卟啉辅基缀合而成，是一种
26、血红素蛋白(hemoprotein)。主要存在于植物细胞的过氧化物酶体中。具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。植物体中含有大量过氧化物酶，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物活性氧保护系统中，其重要作用的是APX，GPX。,在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。如：过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度。所以，过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。目前，辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶及从多种植物中提取的过氧化物酶在含酚废水及含难降解的芳香族化合物废水、造纸废水处理中进
27、行广泛的应用。可降低有毒有机污染物的含量取得很好的效果。,在本实验中氢供体是愈创木酚，在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化，生成茶褐色物质（4-邻甲氧基苯酚），该物质在470nm处有最大光吸收，可用分光光度计测量生成物的含量。,实验用品,材料：马铃薯块茎或豆芽或其它植物材料。器材和仪器：分光光度计、台式高速冷冻离心机、天平、研钵试剂：提取液20 mmol/L KH2PO4，反应混合液：100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)50 ml+愈创木酚28 L，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19 L，混合均匀，保存于冰箱中。,方
28、法步骤,1、称取马铃薯块茎1g（或2g豆芽），加5 mL 20 mmol/L KH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，匀浆液装于10mL小离心管中，在4下以5000 g离心10分钟，取上清液即为酶的粗提液，用4mL 20 mmol/L KH2PO4洗涤沉淀,离心合并上清液,定容至10mL。,2、取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液2.5 ml，KH2PO4 0.5 ml，作为校零对照；另1只中加入反应混合液2.5 ml，上述酶液0.5 ml迅速混匀，于分光光度计上测量3至5分钟的吸光度值，每隔30秒钟读数一次，读数于波长470 nm下进行，以A470值对反应时间做POD的反应进程曲线。,实
29、验结果,POD酶活性计算：以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/mingFW表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（u）表示。,以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。式中：A470为反应时间内吸光值的变化；W为所称样 品重，g；t为反应时间，min；VT为提取酶液总体积，mL。,n,W,注意事项,根据酶活性大小可测定03 min或05 min的OD值，取变化均匀一段求平均值计算。酶提取过程中注意保持低温。,思考题,测定酶的活性要注意控制那些条件？要测定过氧化物酶的活性，除比色法外，你还知道其他什么方法?,实验
30、作业,完成实验报告,实验六：根系活性的测定（萘胺氧化法）,目的要求,掌握萘胺氧化法测定植物根系活力的原理与方法。,基本原理,植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。测定根系活力为植物营养研究提供依据。植物的根系能氧化吸附在根表面的萘胺，生成红色的羟基1萘胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色，其反应如下：,根对萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切关系。有报道认为萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的催化作用，该酶的活力愈强，对萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可根据染色深浅定性地判断根的活力；也可测定溶液中未被氧化的萘胺量，以确定根系
31、活力的大小。萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定萘胺含量。,实验用品,材料：水培或砂培水稻、小麦、玉米，大蒜，洋葱等植物根系。器材和仪器：分光光度计、电子天平、培养箱、三角烧瓶、量筒、移液管、容量瓶等,试剂：萘胺溶液（称10 mg 萘胺，先用2ml左右的95%酒精溶解，然后加水到200 ml，成50 g/ml的溶液。另取150 ml 50 g/ml溶液再加水150 ml成25 g/ml的萘胺溶液），0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），1%对氨基苯磺酸（将1g对氨基苯磺酸溶解于100 ml 30%的醋酸溶液中），亚硝酸钠溶液（称10 mg亚硝酸钠溶于
32、100 ml水中）。,方法步骤,1、定性观察：用水冲洗根部所附着的砂粒，洗净后再用滤纸吸去附着在大蒜根上的水分。然后将植株根系浸入加有50 g/mL的萘胺溶液与磷酸缓冲液(pH7.0)等量混合液50 mL的 三角烧瓶（100 mL）中。容器的外面用黑纸包裹，静置2436小时后观察根系着色状况。着色深者，其活力较着色浅者为大。,2、定量测定：1）萘胺的氧化：-取出培养的植株，并用水洗净根系上的砂粒，剪下它的根系，再用水洗，待洗净后用滤纸吸去根表面的水分，称取12 g放在100 mL三角烧瓶中。然后加50 g/mL的萘胺溶液与磷酸缓冲液(pH7.0)等量混合液50 mL，轻轻振荡，并用玻璃棒将根全
33、部浸入溶液中，静置10分钟。-吸取2 mL溶液，测定萘胺含量测定方法见下面(2)，用为试验开始时的数值。-再将三角烧瓶加塞，放在25恒温箱中，经80 min后，吸取2 mL溶液，再进行测定萘胺含量。-另外，还要用一只三角烧瓶置同样数量的溶液，但不放根，作为萘胺自动氧化的空白，也同样吸取2 mL溶液，测定萘胺含量，求它自动氧化量的数值。-每次取样均为三次重复。,2）萘胺含量的测定：-吸取2 mL待测溶液，加入10 mL蒸馏水，再在其中加入1mL1%对氨基苯磺酸溶液和1mL亚硝酸钠溶液，在室温中放置5分钟，待混合液变成红色，再用蒸馏水定容到25 mL。在2060分钟内进行比色。选用波长510 nm
34、，读取吸光度，查对标准曲线得相应的-萘胺浓度。,3）绘制-萘胺标准曲线：-取浓度为50 g/mL的-萘胺溶液，配制成浓度为50、40、30、20、10、5、0g/mL的系列溶液，各取2 mL放入试管中，加蒸馏水10 mL，1 mL 1%对氨基苯磺酸溶液，和1 mL亚硝酸钠溶液，在室温中放置5分钟，混合液即变成红色，再加蒸馏水定容到25 mL，在20 60分钟内进行比色，波长为510 nm，读取吸光度OD，然后以OD 510为纵坐标，-萘胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。,实验结果,1绘制萘胺标准曲线。2计算根系活力。-用试验开始（10分钟）时的-萘胺含量减去自动氧化的-萘胺量，再减去试验结束时-萘
35、胺含量，即得试验其间为根系所氧化的-萘胺量。-被氧化-萘胺量以g/hgFW表示之。,根系活力=氧化-萘胺量/（W t）（g/hgFW）,注意事项,根系应吸干水分但不能用力挤压伤及细胞，才能测定准确。,思考题,1、测定根系活力有哪些方法？1）-萘胺氧化法 2）甲烯蓝吸附法 3）氯化三苯基四氮唑(TTC)法2、植物根系的主要作用？1）对地上部分起支持和固定作用 2）物质的储藏 3）对水分和无机盐类的吸收 4）合成氨基酸、激素等物质,实验七 丙二醛含量测定,目的要求,熟悉植物组织内丙二醛（MDA）含量的测定原理与方法 了解丙二醛积累对细胞的伤害,基本原理,植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂
36、过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5 三甲基恶唑 2,4-二酮），在 532 nm 处有最大光吸收。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532 nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450 nm。植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除前者的干扰，通常加入低浓度Fe3+（使其终浓度为0.5 nmol/L，植物组织中铁的含量一般为100300 gg-1DW-1），以增加TBA与糖的显色反应产物在450 nm处的吸收。采用双组
37、分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。,实验用品,1材料：植物的根或叶片。2器材和仪器：研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管3试剂：10%三氯乙酸（TCA），0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液（称取硫代巴比妥酸 0.6 g 溶于10 TCA 溶解并用其定容至 l00 mL）。,方法步骤,1MDA 的提取：称取植物材料 1 g，剪碎，加入2 mL 10%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 6 mL TCA 研磨、洗涤，匀浆转移至离心管中，在 4000 r/min 离心 10 min，上清液为样品提取液，定容至10 mL。2.显色反应和测定：吸取离心的上清液2 m
38、L（对照加2 mL蒸馏水），加入2 mL 0.6%TBA 溶液，摇匀，将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取出试管并冷却，4000 r/min 离心 10 min。取上清液定容至4mL，测定532 nm和450 nm 处的吸光度值。,实验结果,1计算：MDA-TBA反应产物的最大吸收峰在532 nm，TBA-可溶性糖的反应产物的最大吸收峰在450 nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，他们的浓度C和OD值之间有如下关系：OD1=Caa1+Cbb1（1）OD2=Caa2+Cbb2（2）式中：OD1为
39、组分a和组分b在波长1时光密度值之和；OD2为组分a和组分b在波长2时光密度值之和；Ca为组分a的浓度（mol/L）；Cb为组分b的浓度（mol/L）；a1、b1分别为组分a、b在波长1处的摩尔吸收系数；a2、b2分别为组分a、b在波长2处的摩尔吸收系数。已知蔗糖与TBA反应产物在450 nm和532 nm的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40；MDA与TBA显色反应产物在450 nm波长下无吸收，吸收系数为0，于532 nm波长下的摩尔吸收系数为155000。根据（1）、（2）可得：OD450=Ca*85.4(3)OD532=Ca*7.4+155000*Cb(4)求方程得：Ca=11.71OD450(5)Cb=6.45OD532-0.56OD450(6)式中：Ca为可溶性糖的浓度mmol/L；Cb为MDA的浓度mol/L。,2.用上述方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA（mol/g FW）,MDA浓度提取液体积/植物组织鲜重,注意事项,要求分光光度计的波长准确，测定OD值最好在0.2-0.8之间。,思考题,比较正常状况下植物组织中MDA含量与逆境情况下有何不同，并分析其中的原因。,
