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1、减毒活疫苗,1,第一个用于人体的减毒活疫苗,1902年，从患结核病的牛乳房里分离得到一株牛型结核杆菌；Calmette和Guerin将此菌接种于5%甘油胆汁马铃薯培养基，进行传代培养；每隔2-3周传代一次，经过230余代，历时13年，终于制备出减毒活疫苗卡介苗(bacille Calmette-Guerin，BCG)。,2,第一节 减毒活疫苗的原理与现状,3,一、减毒活疫苗的原理,减毒活疫苗模拟自然发生的感染后免疫过程。,全身性感染（病毒性/细菌性感染）,临床感染或亚临床感染(隐性感染),持久性的免疫力,临床现象,4,1.定 义,减毒活疫苗通过不同的方法手段使病原体的毒力(致病性)减弱或丧失后
2、获得的一种 的疫苗制品。,由完整的微生物组成,5,2.减毒活疫苗的特点,能引发机体感染、但不发生临床症状其免疫原性足以能刺激机体的免疫系统、产生针对该病原体的免疫反应在以后暴露于该病原体时，能保护机体不患病或减轻临床过程。,6,二、减毒活疫苗的使用和研究现状,使用现状有的已完成历史任务而退役牛痘苗有的已经并正在继续发挥其良好的防病作用脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗有的在长期使用后又面临新的挑战卡介苗有的在我国使用时间不长，尚待积累功绩水痘减毒活疫苗,7,2.传统减毒活疫苗的局限与不足,无法或很难用传统技术研制疫苗不能培养或难以培养的病原体有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体保护效果差、副反
3、应大或使用不方便,解决办法：使用基因工程技术对其进行改造或取而代之,8,3.国内外使用的减毒活疫苗一览表,9,三、减毒活疫苗的研究策略,选择标准的疫苗株;新的抗原结构能诱导广泛的中和抗体;诱导在多样主要组织相容复合体(major histocompatibility complex，MHC)背景人群的多位点的CTL应答;直接和间接地诱导传播途径的黏膜免疫应答,10,1.病原体的培养,如何减毒？体外细胞培养低温培养传代以产生冷适应株在特定温度下选育温度敏感株动物体内分段或连续传代,11,1.病原体的培养,如何筛选？蚀斑法挑选（产生细胞病变效应的病毒）同一病毒：蚀斑较大的：毒力相对强蚀斑小的：毒力
4、较弱其减毒性在人体中必须是稳定的减毒与免疫原性之间的平衡减毒适度：保证人体使用安全良好免疫原性：足以诱生特异性免疫应答,致细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)培养的单层细胞、接种病毒后导致细胞的萎缩、脱落等病变的现象。,12,第一代减毒变异株12-1-7,原代地鼠肾细胞(PHK),连续传代：100代,SA14,SA14-14-2/PDK,例：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株,乳鼠体内传代,SA14-14-2/PHK,蚀斑克隆,病毒株SA14-5-3,PHK细胞,性状不稳定神经毒力返祖,减毒过度，免疫原性不足,PHK细胞,恢复一定的免疫原性,蚀斑克隆,原代狗肾
5、细胞(PDK),传9代,减毒与免疫原性达到平衡,13,2.减毒的策略,传统方法：细胞传代动物传代蚀斑挑选化学诱变营养突变等,现代方法：应用基因工程技术，删除致病基因病原体减毒更彻底遗传性能更稳定安全性和免疫原性更平衡。,14,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine)将与毒力有关的基因或基因片段删除，从而获得缺失突变毒株优点：突变性状明确稳定、不易发生毒力返祖,15,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine)DNA病毒去除毒力基因的腺病毒，可用作减毒活疫苗株，也可作为载体疫苗
6、的病毒载体。RNA病毒,16,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,2.遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)通过强、弱毒株共同感染细胞，二者之间进行基因片段的交换，而获得的减毒活疫苗。特点：很大的盲目性，致使筛选特定的遗传重组病毒比较困难。,17,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,2.遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)反向遗传技术的发展，可以对分节段的RNA病毒进行定向重配，提高重配效率。研究热点：甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活疫苗株。,18,载体疫苗(vector vaccine)利用非致病微生物作为载体、递呈外源抗
7、原的一种减毒疫苗。将外源抗原的基因插入到载体微生物基因组中，用这种表达外源抗原的微生物作为疫苗。,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,19,四、基因工程减毒活疫苗的构建策略,病毒载体疫苗痘苗病毒腺病毒麻疹病毒脊髓灰质炎病毒等,细菌载体疫苗产单核细胞李斯特菌沙门菌霍乱弧菌志贺菌卡介苗小肠耶尔森菌炭疽杆菌戈登菌属乳杆菌属葡萄球菌属等,载体疫苗(vector vaccine),成本低适于群体免疫,20,五、减毒活疫苗研究面临的问题,1.安全性成功或比较成功的预防性疫苗牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎、乙型脑炎等减毒活疫苗不太成功的疫苗：卡介苗半个多世纪、40余亿人群使用对肺结核的免疫保护效果：差异甚
8、大(0-80%)迄今尚没有一个国家或地区有消灭结核的可能性,改造研究是热点,21,五、减毒活疫苗研究面临的问题,2.安全性和免疫原性之间的协调难题Ty21a口服伤寒减毒活疫苗最成功的营养缺陷型突变,营养缺陷型突变,人结核菌H37Rv,亮氨酸缺陷株,残余毒力指数过高,22,五、减毒活疫苗研究面临的问题,2.安全性和免疫原性之间的协调难题霍乱减毒活疫苗：基因缺失株CVD112：保护率：84%6名志愿者中：引起3人轻度腹泻CVD-103 HgR株：对不同人群诱导 抗体应答悬殊免疫原性不恒定,23,五、减毒活疫苗研究面临的问题,3.载体疫苗研究中存在的问题载体微生物蛋白的过量表达，严重干扰欲表达抗原诱
9、导机体免疫应答;非复制型载体微生物（如禽痘病毒）的减弱或消失，导致目的抗原表达量降低，影响疫苗免疫原性;目的抗原微生物和载体微生物感染途径不一定相同，而致使目的抗原不能经自然感染途径免疫，从而影响免疫效果。,24,第二节 减毒活疫苗设计与制备的技术要求,25,一、减毒活疫苗的设计要求,设计减毒活疫苗菌株或毒株，要根据生物制品的用途、使用范围、使用方式、生产过程和生产条件等因素来决定，设计时应注意以下问题：安全性免疫原性遗传稳定性生产适应性,26,1.安全性,残余毒力残余毒力高：免疫原性：临床反应：残余毒力低：免疫原性：临床反应：所选用的菌、毒种必须在减毒性能和免疫原性之间达到平衡,好,大,差,
10、小,27,1.安全性,致癌性菌、毒种及代谢物质：不应有致癌作用;传代细胞系：在规定代次内使用，有效去除细胞DNA，残余DNA需达标;,诱变及筛选菌/毒株：不用致癌性的药物;载体疫苗：载体是无毒或减毒的外源基因插入时，不应引起毒力的返祖。,28,2.良好的免疫原性,能促使机体产生：高效价的保护性抗体黏膜免疫细胞介导免疫并具有良好的免疫持久性,29,3.遗传稳定性,弱毒株的来源？天然弱毒采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒株诱变为弱毒株只有选择突变遗传性能稳定的菌毒株，才能最大限度地防止其使用过程中毒力返祖的可能。,30,4.生产适应性,易于培养便于规模化生产有利于生产工艺流程的可操作性和简
11、化有利于保证产品的产量和质量。,31,二、减毒活疫苗制备技术要求,基本要求设施与生产质量管理中国药品生产质量管理规范原、辅料:中华人民共和国药典、中国生物制品主要原辅材料质控标准纯化水和注射用水：中华人民共和国药典 生产用器具:必须清洗干净、灭菌处理。生产及检定用动物:鸡胚细胞的来源鸡群：SPF级提供肾脏的家兔、狲猴：隔离检疫合格小鼠、地鼠、豚鼠：清洁级,32,二、减毒活疫苗制备技术要求,2.菌、毒种国家药品管理局批准由国家药品检定机构或国家药品管理局所委托的单位保存、检定及分发。,33,二、减毒活疫苗制备技术要求,菌、毒种的三级管理：定期全面检定原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性
12、。主种子批从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保存的。工作种子批从主种子批制备，用于生产。主种子批和工作种子批在规定代次内的生物学特性应与原始种子批一致,34,3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求,(1)培养基的制备菌种用培养基疫苗生产用培养基检定用培养基等,(2)菌种培养不同细菌，要求不同：培养基培养温度培养时间菌落形态、颜色等,严格按照中国生物制品规程,35,3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求,(3)原液制备液体培养基：收集菌膜，经洗涤、离心、压干等不同处理步骤后，加 适量保护液制成所需浓度的原液。固体培养基：将菌苔刮入保护液，或用保护液洗下菌苔制备原液。(4)分装、包装。,严格按照中国生物制品
13、规程,36,3.细菌性减毒活疫苗制备技术要求,(5)检定对菌种、原液、半成品和成品进行检定保证疫苗的安全性和免疫原性等质量标准符合中国生物制品规程,严格按照中国生物制品规程,37,检定什么？,纯菌试验:生长物做涂片镜检，不得有杂菌。噬菌体特异性试验:特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应无细菌生长。菌落、菌形检查:应具有典型的菌落特征涂片镜检：培养典型形态特殊染色法：形态学鉴别,38,检定内容,活菌数测定:一定温度、时间培后，单位体积的活菌数必须在规定范围内。浓度测定:按中国细菌浊度标准测定浓度。毒力试验:一定量的菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠，要求：实验动物存活体重增加,39,检定内容,效
14、力或免疫力试验:制备菌液，注射小鼠、豚鼠等实验动物一般免疫两次末次免疫后，用野型株进行攻击一般应保护50%80%的动物存活。,各制品的合格指标不同，应按规程进行判定。,40,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(1)生产细胞 适用于病毒性疫苗生产/检定的细胞有：二倍体细胞 传代细胞原代细胞,41,人二倍体细胞株,来源:正常人胎肺或其他组织需进行全面检定建立的细胞株的审批：新生物制品审批办法建株资料：所用胎儿的胎龄和性别，终止妊娠的原因;胎儿父母的年龄、职业及健康状况，胎儿父及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史;原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长情况;细胞培养的方法、历史、生长特征和寿命的世
15、代数;细胞的生长液成分。,42,人二倍体细胞株的建株,染色体检查：每8-12世代作一次至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查;至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，做出核型分析;粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率;每次染色体检查标本片应长期保存，以备复查;细菌、真菌、支原体及病毒检查致肿瘤性检查,43,传代细胞系,由人或动物肿瘤组织或正常组织传代转化而来，可悬浮培养或用载体培养，能大规模生产;可无限传代，但到一定代次后，致肿瘤性会增强，所以对生产用的传代细胞系应进行严格检查。,44,传代细胞系的相关资料,需得到国家药品监督管理局的批准，并提供有关资料:细
16、胞系来源，供者的种属、年龄、性别和健康状况的描述;细胞传代培养方法、生长特征、传代数，用于生产的最高限制代数，所用生长液以及传代史等描述;初步确定可能存在的外源因子检查结果;,45,传代细胞系的相关资料,d.细胞系的生长类型及形态学特征、细胞鉴别的特殊标志、遗传特征(如HLA、DNA指纹图谱);e.提供细胞系用于预定目的的资料;f.细胞系的生产用限制代次和超过该代次10代以上的生物学特征，要做出说明。,46,原代细胞,来源：猴肾、鸡胚、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑胚，以及其他组织等。正常组织经消化后、进行细胞培养。只限于原始或少数几代(一般在5代)以内使用，以生物学性状不发生改变为原则。
17、,47,原代细胞的使用注意事项,在接种病毒或用于生产前，应进行外观和镜下检查，应无任何可疑、异常和病变。每批细胞培养留取5%-10%（至少留有500ml）悬液，不接种病毒，至少观察14天，并做细菌、真菌和支原体检查。,48,原代细胞的使用注意事项,c.原代细胞来源的动物必须健康，尽量使用无特定病原体(SPF)动物d.对拟订用于生产的动物种群，应定期检查有无相关病毒抗体，应严格筛选。e.用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。,49,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(2)生产细胞的三级管理 原始细胞库通过检定证明（适合于生物制品生产和检定）的原始细胞群
18、体，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或-100以下冻存备用。,目的:每一生产周期，都能提供一个已标定好的、相同质量的细胞源。,50,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(2)生产细胞的三级管理 主细胞库取原始细胞种子，通过细胞传代，增殖到一定数量，将所有的细胞均匀混合成一批，定量分装于安瓶，于液氮或-100以下冻存备用。,目的：主细胞库的细胞通过全面检定后，建立工作细胞库。,51,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(2)生产细胞的三级管理 工作细胞库细胞由主细胞库传代扩增而来，冻存时细胞的传代水平需确保细胞复苏后、传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批产品。传代水平必须在该细胞用于生产限制最高
19、代次之内。,52,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(2)生产细胞的三级管理 生产用细胞取冻存的工作细胞库中一个或多个安瓶，混合后培养，传一定代次后供生产制品使用。传代次不得超过该细胞可用于生产的最高限制代次。,剩余的生产用细胞，不再冻存和再用于生产。,53,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,(2)生产细胞的三级管理 体外培养细胞龄计算一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代根据每个细胞系的实践经验数据，确定生产使用细胞最后限制代次生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的2/3以内。,54,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,生产程序 细胞培养离体细胞的病毒敏感谱广而易被病毒感染，可提供大面积微生物繁殖的基
20、质以保证产量。在生产过程中：不得使用青霉素或其他-内酰胺类抗生素,55,(3)生产程序病毒培养将适量病毒接种到细胞中（感染复制数），在合适的温度及时间内培养病毒致细胞病变(CPE）病毒脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒可参考CPE程度在培养限定时间内终止培养;不产生细胞病变的病毒甲型肝炎病毒：在规定培养时间内终止培养。,4.病毒性减毒活疫苗制备技术要求,56,(3)生产程序,病毒收获及释放经一定培养时间达病毒的增殖高峰期，即应终止培养收获病毒；用研磨、冻融、超声波等处理以释放病毒。半成品制备、糖丸加工、分装、包装按规程进行。,57,(4)检 定,病毒的鉴别试验用一定量的病毒特异性高价血清或有中和抗体特性
21、的单克隆抗体，与一定量的病毒混合，置37中和一定时间后接种细胞培养，以最适温度培养一定时间后判定结果：病毒应完全被中和蚀斑法、病变法、ELISA法个别制品也用小鼠脑内接种来判定结果。,58,病毒的鉴别试验-蚀斑法,病毒特异性高价血清,有中和抗体特性的单克隆抗体,接种,细胞,病毒,蚀斑,细胞,接种,培养,不产生蚀斑,59,(4)检 定,无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。病毒滴定样品作系列稀释，至少取3个稀释度分别接种细胞，在最适温度培养一定时间判定结果。蚀斑法、病变法或ELISA法以及动物试验,60,(4)检 定,外源因子检查病毒外源因子对照细胞外源因子每批生产用细胞应留取一定量作为对照细胞（
22、不接种病毒），与接种病毒的细胞用相同的细胞维持液，在相同条件下培养后进行外源因子检查,61,(4)检 定,免疫原性检查用主种子批制成疫苗常规接种易感者检测抗体：免疫前和免疫后4-6周阳转率：不低于规程要求人数：一般不少于30人。个别制品：也可以小鼠免疫、攻击试验检查其免疫原性。,62,(4)检 定,热稳定性试验疫苗成品在37放一定时间后，测其病毒滴度，其病毒滴度下降不得大于规程规定。,63,第三节 减毒活疫苗的综合评价,64,一、减毒活疫苗的优缺点,优点：诱导体液免疫和细胞免疫两种免疫反应有的制品：通过自然感染途径接种，还可以诱导出黏膜免疫，使机体获得较广泛的免疫保护。使用的是活的微生物，可在
23、机体内长时间起作用、而诱导较强的免疫反应。活的微生物有再增殖的特性，理论上只需接种一次，即可以达到满意的免疫效果。,65,一、减毒活疫苗的优缺点,优点：可能引起水平传播，扩大免疫效果，增强群体免疫屏障；无需添加佐剂；生产工艺一般不需要浓缩纯化；价格低廉。,66,一、减毒活疫苗的优缺点,缺点：一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体（如免疫缺陷者）可能诱发严重疾病。由于种种原因（如基因修饰等），减毒活疫苗有可能出现毒力返祖现象。是活微生物制剂，可能造成环境污染、而引发交叉感染等。,67,一、减毒活疫苗的优缺点,缺点：缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫效果。产品的分析评估较为困难。保存、运输等条件要求
24、较高，如需冷链等。,68,二、减毒活疫苗使用策略的评估,1.免疫程序 理论上:活微生物在体内的再增殖特性：单剂免疫方案实际上：单剂免疫：往往达不到理想保护效果因为：传统减毒活疫苗往往减毒又减免疫原性新型疫苗（非复制型微生物载体疫苗等）所表达的抗原量也往往偏低,69,1.免疫程序,脊髓灰质炎减毒活疫苗（1960-）单价、双价、三价剂型1、2、3、4剂免疫方案目前方案：三价疫苗4剂免疫（1986）首次免疫：2月龄间隔4-6周：再连续免疫2次 4岁：加强免疫1次。,70,脊髓灰质炎减毒活疫苗不同免疫程序比较,本疫苗已使我国本土消灭了由野型株引起的脊髓灰质炎,71,甲型肝炎减毒活疫苗,免疫效果比较:诱
25、导的抗体反应与剂量正相关两针免疫接种方案：受到日益广泛的重视和研讨。,72,1.免疫程序,应根据对疫苗保护效果及其持久性的要求来制订并完善,73,2.免疫途径,自然感染：绝大部分病原体通过黏膜入侵机体减毒活疫苗的免疫接种：大多数采用非肠道途径(如皮下注射、皮上划痕),74,非肠道途径免疫接种途径的缺点,免疫诱导位点不定向产生的免疫反应仅为系统免疫、缺乏局部应答;免疫接种人员需要培训，需使用接种器材，不仅造成给药成本较高，且有潜在交叉污染可能;接种时引起的局部疼痛以及其后的局部反应往往不易被免疫对象所接受,75,自然感染途径免疫接种,脊髓灰质炎减毒活疫苗（口服）取得了非常成功的个体和群体免疫保护
26、效果。黏膜途径免疫：受到日益重视和深入研究消化道呼吸道泌尿生殖道,黏膜某处受抗原刺激的免疫活性细胞会在其他黏膜部位产生相应的特异免疫反应,76,黏膜免疫的优势:,发挥黏膜第一屏障作用，阻止病原体入侵甚至在局部清除;诱导包括局部和系统应答在内的全面免疫保护效果;免疫方便，副反应小，安全性好，易被免疫对象接受;给药成本低，疫苗制备成本也低。,77,3.母体免疫(maternal immunization),传统：孕妇是免疫接种的禁忌者近20年：“孕妇免疫”新动向作用:提高妇女怀孕期的健康水平（预防急性传染病)母体抗体可通过胎盘、乳汁等垂直传递给胎儿和新生儿，使其在出生后的一段时间具备抵抗外来微生物
27、侵犯和预防疾病的能力。,78,孕妇免疫用疫苗,十余种疫苗试验：如破伤风类毒素，乙肝、流感和脊髓灰质炎疫苗等。流感疫苗母体：流感抗体升高新生儿：得到被动免疫保护美国疾病控制和预防中心推荐：在流感高发季节，孕妇在怀孕期第4个月以后可以使用。,79,母体免疫需要逐步、慎重地开展,有利的母体免疫：呼吸道合胞病毒(RSV)引起新生儿下呼吸道感染的主要病原体母体破伤风抗毒素：对胎儿有保护作用不利的母体免疫：B组链球菌疫苗免疫（怀孕期第7-9个月）：可能导致胎儿死亡。,80,三、疾病性质与疫苗效果的评估,疫苗的效果取决于：疫苗的质量疾病的特性社会生态环境经济条件管理水平,81,天花为什么能被消灭？,宿主单一
28、：人：天花病毒的唯一宿主，疫苗覆盖面明确;症状明显：几乎所有感染者有明显的、有特点的皮疹；传染期较短传染源易被发现、监控传播途径易于切断,疾病的特性,82,天花为什么能被消灭？,感染后终生免疫，获得性免疫效果好;牛痘苗安全有效，价格低廉，利于大面积免疫接种保护易感人群;1958年，世界卫生大会通过了在全球开展消灭天花运动的决议。,管理水平,经济条件,83,传染病,人类独有的疾病：麻疹、脊髓灰质炎、腮腺炎、风疹、乙型肝炎、白喉、百日咳等人兽共患性疾病：狂犬病、乙型脑炎、森林脑炎、出血热、鼠疫、炭疽等宿主：人、家畜、鼠类等。,有可能被消灭,不可能被消灭,84,四、减毒活疫苗的前景,存在问题：安全性毒力返祖疫苗相关病例优势：最近似于病原体的自然感染过程，可以诱导较为全面的免疫应答,85,四、减毒活疫苗的前景,自然界中的病原体变种，在病原微生物种群平衡上的可能走向？2001年以来，在中美洲分离到几株在自然循环过程中发生重组的脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒因此在相当时期内，有大量的探索工作要做，还将继续在多种传染病的预防中发挥其重要作用。,86,谢谢！,87,
