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1、分子生物学常用实验技术The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology,现代分子生物学,遗传中心法则与组学 遗传信息传递的基本规律分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用 分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质-核酸相互作用工具酶的应用,遗传中心法则,基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；DNA所占的中心位置；RNA是信息表达的体现；蛋白质执行生物学功能。基因工程的基本原理!生命的起源？,基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系,基因组
2、学是基础、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。,整合也是创新,方法的结合形态与机能研究的结合 中西医的结合,21世纪分子医学发展的主要领域,分子诊断基因治疗生物工程药物,第一讲蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析Isolation,Purification,Identificationand Structural Analysis of Proteins,一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:是常用的蛋白质沉淀方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitati
3、on)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,水化膜,带负电荷的蛋白质,溶液中蛋白质的聚沉,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,二、透析及超滤法:可清除蛋白质溶液中的小分子化合物,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,超滤法,透析(dialysis),三、电泳:是蛋白质
4、分离与鉴定的常用方法,电泳(elctrophoresis)蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳：,蛋白质的二维电泳,二维电泳图,四、应用相分配或亲和原理：可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多
5、少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析(chromatography),离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,沉降系数(sedimentation coefficient,S)蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状
6、相关。,因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,六、用化学或反向遗传学方法：可分析或演绎多肽链的氨基酸序列,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,氨基酸和肽的末端测定法,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码
7、蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测,通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例,X射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,（二）X射线衍射法和核磁共振技术：用于三维空间结构分析,1A,2.
8、Structure of dCTP,3.Base Tautomerism,Chargaff rules-A=T,G=C,helical,10 layer Lines BetweenCrossPatterns(10 ResiduesPer turn),Evidence for the Double Helix,1.Fiber Diffraction data:-Helical geometry-3.4 A spacing(1A=10-10 m)-34 A pitch,*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,（三）根据氨基酸序列：预测蛋白质三维空
9、间结构,*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,30,第二讲DNA操作的基本技术,The Basic Technologies for DNA Manipulations,31,核酸印迹技术与分子杂交,Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization,32,什么是核酸分子杂交,核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）以DNA的变性、复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过
10、复性处理后，形成异源双链的过程 可用于基因诊断,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,分子杂交与印迹技术的原理,印迹技术,利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。,用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链
11、被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。是基因诊断的常用技术,探针技术,基因诊断之父简悦威,1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫血进行诊断。,基因诊断的概念、特点及临床意义,定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽(分子诊断）。,诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因
12、异常激活或灭活。,基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性,基因诊断中常用的分子生物学技术,核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNA sequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Western blotting）免疫组织化学诊断,基因诊断中常用的分子生物学方法比较,印迹技术,44,一、Southern 印迹:可用于分析基因拷贝数的变化,由E.M.Southern在1975年提出可用于分析基因拷贝数的变化基本操作过程包括待测D
13、NA样品的制备和基因探针的标记；待测DNA样品的电泳分离；电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。,Edwin Southern,Sir Edwin Southern(born 1938),US biologist and deviser of the DNA analytical technique Southern blotting.This technique uses enzymes to fragment DNA(deoxyribonucleic acid),and the fragments a
14、re then separated in an electrophoresis gel.The separated fragments are then blotted onto a nitrocellulose filter and marked with radioactive probes.The probes indicate the presence of specific genes(lengths of DNA that code for proteins).A sheet of photographic film is then laid over the filter.The
15、 radioactivity darkens the film,which reveals the position of genes in the DNA.This technique is widely used in genetic research.Photographed in the 1980s.,核酸分子杂交流程,待测核酸制备,滤膜上核酸固化,杂交,去除未杂交的探针,检测杂交信号,核酸探针制备,探针标记,加入标记探针,47,Southern印迹分析基本流程,滤纸NC膜凝胶滤纸,缓冲液,Northern 印迹,RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的
16、mRNA分子的含量与大小。,Northern印迹杂交(Northern blotting),50,二、Northern 印迹和RT-PCR:可用于分析基因转录水平的变化,Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法；RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化。,三种印迹技术的比较,52,三、原位分子杂交技术:可用于基因及其表达产物的定位分析,原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表
17、达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。,53,（一）利用原位杂交技术:进行基因定位分析,荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH）,斑点杂交（dot blotting）,将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。,反向斑点杂交（reverse dot blotting）,先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂
18、交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。,56,FISH,箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置,荧光原位杂交（FISH）,58,（二）利用原位杂交技术:确定特定基因的表达定位,RNA原位杂交 整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization,WISH）,固相夹心杂交法(sandwich hybridization),待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针
19、与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。,固相夹心杂交法示意图,基因诊断技术路线与方法,直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析,根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。,（一）直接诊断途径,必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知,5/,5/,3/,3/,RFLP,1.点突变的检测（1）有限制性内切酶位点改变,斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序,5/,5/,3/,3/,（2）
20、无限制性酶切位点改变,在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。,2.基因重排的检测,核酸分子探针杂交与PCR,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断,-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血,根据引物3端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物,等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）,3.基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mR
21、NA的绝对定量分析 mRNA长度分析,（二）间接诊断途径,1.采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测,DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。,2.遗传标记,间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记,三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide p
22、olymorphism),7.6kb,13kb,患者,正常,HbS的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析,Hap,7.6kb,13kb,Southern印迹杂交,N H P,N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针,73,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,74,什么是聚合酶链式反应,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。,Th
23、e Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Mulls Nobel Prize for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method B.1944,76,PCR技术的工作原理,53,35,+,+,5,5,变性、退火,引物,53,35,+,5,5,dNTPs,Taq DNA聚合酶,不同长度新链DNA,循环1,+,引物,变性、退火,77,2530 次循环后，模板
24、DNA得到扩增,53,35,+,53,35,+,+,dNTP Taq DNA 聚合酶,均一长度新链DNA,循环2,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR）,模板引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶,变性,延伸,退火,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,PCR体系基本组成成分,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。,PCR技术的
25、主要用途,（一）目的基因的克隆,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（二）DNA和RNA的微量分析,（三）基因突变,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,（四）DNA序列测定,（五）基因突变分析,PCR在基因诊断中的应用,RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASOAS-PCRPCR-SSCPPCR-R
26、FLP,RT-PCR,85,一、PCR技术分析基因及其产物,反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。,86,反转录合成cDNA,多重PCR,多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR,寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。,等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonuc
27、leotide,ASO）,PCR-ASO,N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）,DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。,PCR-SSCP分析原理示意,正常人,纯合突变,杂合突变,+,PCR-SSCP分析,限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP）,由于DN
28、A 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。,设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。,PCR-RFLP,GAATTC,CTTAAG,EcoR 限制性内切酶位点的变化,1985年，英国遗传学家Jeffeys等人用TR的核心序列为探针进行RFLP分析时，检测到许多HVR，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为DNA指纹图谱（DNA fing
29、erprinting）。,Alec John JeffreysOxford,United Kingdom,目 录,Alec John Jeffreys,亲权鉴定与DNA指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。,DNA指纹用于罪犯识别,99,二、PCR技术可以进行实时、定量分析,Q,R,3,3,5,5,上游引物,下游引物,荧光标记引物,R,Q,3,3,5,5,100,三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列,PCR与点突变,重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互
30、补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。,重叠延伸PCR技术,此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因扩增等方面有其广泛而独特的应用。,104,DNA序列测定,DNA Sequencing,105,DNA序列分析方法的演变和发展,20世纪70年代双脱氧链终止法：F.Sanger
31、化学裂解法：A.Maxam和W.Gilbert20世纪80年代PCR及自动测序技术,106,一、DNA序列分析:有双脱氧链终止法和化学裂解法,（一）Sanger双脱氧链终止法利用2，3-双脱氧核苷酸掺入（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应,The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particular regard to recombinant-DNAfor their contributio
32、ns concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger,108,双脱氧链终止法,109,DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应。反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,111,DNA序列自动分析,ddG
33、,红,ddT,ddA,绿,ddC,蓝,橙,毛细管电泳,荧光标记,DNA合成,测序结果展示,DNA序列测定（DNA sequencing）,113,二、DNA序列分析:可以揭示基因和基因组一级结构变化,通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异通过DNA序列测定分析人工重组的基因通过DNA序列测定对定点突变进行确认,左侧：正常；右侧：突变,序列分析用于基因诊断研究（黄金标准）,大规模基因组测序,Megabace 测序仪,3700 测序仪,116,DNA芯片技术,DNA Chip Technologies,117,什么是DNA芯片技术,DNA芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸
34、或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。,特定基因检测突变检测多态性分析基因表达谱,基因芯片的应用,生物信息学的工具基因相关性研究基因功能药物设计和开发潜在反义试剂开发个体化医疗身份识别基因诊断其他与生物有关的领域,119,基因芯片工作流程,121,一、利用DNA芯片技术:可同时进行高通量基因转录活性的分析,cDNA芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段PCR产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片
35、段为探针，每个基因有1020个相对应的探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。,122,二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合:检测蛋白质-DNA相互作用,染色质免疫共沉淀-芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。,（一）ChIP-on-chip的基本原理是染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合,123,ChIP-on-chip工作原理,124,（二）采用两步模型法
36、进行ChIP-on-chip数据分析,两步模型法（two-step paradigm），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处5001 000 bp左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得粗略的目的数据集。第二步对其进行数据挖掘和分析。,125,（三）ChIP-on-chip适于:DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究,主要集中在两个领域：第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与蛋白结合的基因作
37、为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系,126,三、芯片技术的发展蛋白质芯片和组织芯片,蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术多组织片组织阵列组织微阵列,127,第三讲 生物大分子相互作用研究技术酵母及哺乳动物
38、细胞杂交系统,Yeast and Mammalian Hybrid Systems,蛋白质相互作用研究,随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有
39、效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。,蛋白质相互作用研究当前进展,1.利用蛋白质片段互补研究其相互作用和文库筛选2.通过核糖体展示进行相互作用的体外筛选和进化3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用4.蛋白质成束法增强其相互作用的检测5.用计算方法分析全基因组蛋白质的相互作用6.通过蛋白质相互作用发展新的治疗方法7.利用核磁共振法分析蛋白质相互作用,免疫共沉淀,荧光共振转移技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交技术,基因外抑制子,合成致死筛选,分子生物学方法,亲和印迹,Pull down 试验,遗传学方法,蛋白质相互作用研究方法,生物物理学方法,蛋白质相互作用的
40、实验技术,标签融合蛋白（Labeled fusion protein）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）酵母双杂交（Yeast two hybrid system）荧光共振能量转移技术（FRET）表面等离子共振技术（Biacore SPR技术）原子力显微镜技术（Atomic force microscopy）噬菌体展示技术（Phage display）,融合蛋白pull-down实验,融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗
41、脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。,GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合
42、蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用,洗脱（2）,结合（3）,检测（6）,收集（5）,洗脱（4）,固定诱饵蛋白（1）,噬菌体展示,噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。,噬菌体展示技术 Phage display techniques,PDT,大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd和
43、M13,它们只感染含F因子的大肠杆菌。1985年,美国Missouri大学Smith博士等人将R I核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码次要外壳蛋白的基因中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被EcoR核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术的诞生。,噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott等人利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基
44、酸的排列组合方式。由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸,所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依赖的氨基酸残基,从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别,酶与底物的结合等等,突破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致性。到现在已相继成功构建了f1、M13、T4 等噬菌体表达载体,为蛋白质组学的发展提供了有利的工具。,丝状噬菌体,蝌蚪形噬菌体,噬菌体、T4噬菌体、
45、T7噬菌体,M13噬菌体,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱或电泳原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标 签 融 合 蛋 白 沉 淀 实 验 流 程,酵母双杂交系统yeast two-hybrid system,142,一、酵母双杂交:探测蛋白-蛋白的相互作用,酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）由S.Fields 和O.Song 于1989年提出并初步建立,酵母双杂交技术的基本原理,酵母双杂交系统的应用
46、,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息推测分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质,酵母单杂交系统 yeast one-hybrid system,146,二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞,酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）由J.Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法；通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白
47、基因；将文库质粒转入报告株,147,酵母单杂交技术的基本原理,酵母三杂交系统,149,三、蛋白质-RNA相互作用:也可采用酵母三杂交系统进行分析,酵母三杂交系统（yeast three-hybrid system）于1996年由D.J.SenGupta等首先报道（一）用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母三杂交系统需要杂合RNA（二）可鉴定两个已知蛋白质分子之间的桥梁分子，具有广泛的应用潜力,150,酵母三杂交基本原理,151,（三）酵母三杂交系统应用范围广泛,可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；鉴定、分离能够识别具有重要生理功能的RNA结合蛋白。,谢谢各位！,
