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1、发育生物学,第一章 序 言,一、前言(一)概念 发育生物学是一门研究生物体从精子和卵子发生、受精、发育、生长到衰老、死亡规律的科学。发展基础：胚胎学、遗传学、细胞生物学。发展过程：形态 机理 组织器官 细胞 分子,本课程的主要讲授内容,序言：发育生物学中的一些基本原理；发育生物学中的动物模型；发育生物学中的现代技术。胚胎的早期发育：卵裂、原肠作用、神经胚作用。细胞分化的机制：侧重基因表达的调控对组织器官形成和分化的影响。果蝇躯体轮廓发育的分子机制四肢动物的肢体的发育性别决定与生殖细胞,主要参考书,Scott Gilbert编:Developmental Biology，6th Editions
2、,2000.Lewis Wolpert主编：Principles of Development，1998.Klaus Kalthoff:Analysis of Biological Development，2nd edition,2001.Bruce M.Carlson:Human Embryology&Developmental Biology,2nd Edition,1999.,发育生物学相关期刊,(二)、发展历史1、后成论(epigenesis)和先成论(preformation)之争 希腊哲学家Aristotle在公元前第4世纪在对鸡胚和一些无脊椎动物胚胎观察后提出胚胎发育的两种假设：
3、Preformation:生物个体的一切组成部分都早就存在于胚胎中，各个部分随着胚胎的发育而长大。Epigenesis:在胚胎的发育过程中，各种结构是逐渐形成的。,17世纪，意大利胚胎学家 Marcello Malpighi观察到的鸡胚,17世纪，精原学说的代表人物Nicholas Hartsoeker所想像的精子中的微型人法国科学家Bonnet(1745)提出胚胎发育套装论,19世纪30年代末：Mathias Schleiden和Theodor Schwann提出细胞学说。1840,August Weismann提出了生殖细胞论，认为后代个体是通过精子和卵子继承亲本描述躯体特征的信息；卵子是
4、一个细胞，其分裂产生的细胞可分化出不同组织，从而否定了preformation论。19世纪对Sea Urchin受精卵的观察发现，受精卵含有两个细胞核，并最终合并为一个细胞核，表明细胞核含有遗传的物质基础。19世纪末，染色体的发现和发现染色体数目在发育中的变化规律，使孟德尔遗传定律有了物质基础。,2、细胞学说改变了胚胎发育和遗传的概念,3、Mosaic and Regulative Development 19世纪80年代，Weismann提出了mosaic development学说：合子中的大量特殊因子在细胞分裂中不均等分配，导致了不同细胞向不同命运的发育。,3、Mosaic and Re
5、gulative Development(续)支持嵌合体学说的实验证据：Wilhelm Roux的实验：,3、Mosaic and Regulative Development(续)Wilhelm Roux的同事Hans Driesch的下述实验表明，胚胎具有在局部被排除或受损伤后仍正常发育的能力，即胚胎发育是可调节的。,4、Discovery of Induction 1924年，Hans Spemann和Hilde mangold的移植实验表明，胚胎的一种组织可以指导另一种相邻组织的发育。,5、遗传学、分子生物学与发育生物学的结合,1900年，孟德尔遗传定律研究遗传元素在世代间的传递。19
6、09年荷兰植物学家Wilhelm Johannsen提出基因型和表现型的概念，首次使遗传学和胚胎发育学发生关系。20世纪40年代证明：DNA是遗传物质，控制蛋白质的合成。20世纪50年代发现：DNA为双螺旋结构。20世纪60年代：三联体密码被破解。20世纪70年代：DNA重组技术出现。20世纪80年代：转基因技术出现。20世纪90年代：动物克隆技术出现。世纪之交：HGP。新的突破：stem cells,proteomics,conditional gene knockout,mutagenesis,二、发育生物学研究中的主要模式动物 各种模式动物各有优点，其研究成果不仅可以揭示特定物种的特点，
7、还有助于动物发育的一些普遍规律和机制。(一)Invertebrate Models,主要优点1.体积小，易于繁 殖；2.产卵力强；3.性成熟短；4.易于遗传操作：如诱变；5.基因组序列已全 部测出(Science,Mar.24,2000)。(120Mb encodes 13,601 proteins),1.Drosophila melanogaster:Insect model,2、Caenorhabditis elegans:Worm model,主要优点1.易于养殖：成虫 体长1mm，易冷 冻保存；2.性成熟短：2.5-3 天，两种成虫；3.细胞数量少，谱 系清楚；4.易于诱变；5.基因组
8、序列已全部测出(Science,Dec.11,1998)。(97MB encodes 19,099 proteins.),(二)、Vertebrate Models,1.Xenopus laevis:Amphibian model,主要优点1.性成熟短；2.卵体大，易于操 作；3.抗感染力强，易 于组织移植；,主要优点1.体积小，易于饲 养殖；2.产卵力强；3.性成熟短；4.易于遗传操作：如诱变；5.体外受精和发育，易于观察；6.基因组序列已全 部测出。,2.Danio rerio(zebrafish),3.Mus musculus(Mouse),4.Gallus gallus(Chicken
9、),三、发育生物学中的基本概念及规律,(一)、Five major developmental processes1.Cell division:Cleavage:细胞分裂快、没有细胞生长的间歇期，因而新生细胞的体积比母细胞小。,2.Pattern formation:(1)躯体轴线的制定,2.Pattern formation:(2)胚层的形成,3.Morphogenesis最突出的形态变化发生在原肠作用开始之后。,4.Cell dif-ferentiation:人类胚胎可最后发育出至少250种不同细胞类型，分化通常是不可逆的。,5.Growth 胚胎在基本的pattern形成之后，其体积会
10、显著增长，原因在于细胞数量增加、细胞体积增加、胞外物质的积累。不同组织器官的生长速度也各异。,(二)、Cell Behaviour Cell behavior Gene Embryonic development 细胞行为主要包括：Cell state:指基因活性状况。Cell-to-cell signaling:细胞间信号的传送、接受、反应。Cell movement and cell-shape changes:细胞通过形态改变及运 动产生的机械动力，导致特殊结构的形成。Cell proliferation:躯体不同部位的细胞增生速度不一，可导致 整体结构的改变。Cell death:在特
11、定的发育时期，特定部位的细胞的死亡是形成 正确结构所必需的。,(三)、基因控制细胞行为 是通过控制细胞中的蛋 白质的产生而实现的,House-keeping proteins:几乎存在于所有类型细胞中，通常用于产生能量、在代谢途径中生成或降解产物，如组蛋白及转录或翻译中所必需的蛋白因子。Tissue-specific proteins:存在于特殊类型细胞中，从而赋予细胞特定的活性。如血细胞中的血红蛋白输氧、肌肉细胞合成myosin、actin、tropomyosin为收缩提供能量。包括酶、生长因子、受体蛋白、结构分子。细胞可从多个方面来控制蛋白质的合成。,(四)、发育是渐进式的、细胞命运决定于
12、不同的发育时间,Fate of cells:指正常发育情况下细胞将发育的方向，这种方向可因条件的改变而改变(see next slide)。Determination:指细胞特性发生了不可逆的改变，发育潜力已经单一化。Specification:指一组细胞在中性环境下离体培养，它们仍按其正常命运图谱发育。,两栖动物眼区细胞的潜能随发育时期的不同而改变,原肠胚中眼区将发育为眼睛。,将原肠胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，它们将按新部位的命运发育为体节和脊索。,将神经胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，它们仍将发育为类似于眼的结构。,胚胎发育早期，细胞的发育潜力更大！,(五)、诱导作用可使细胞互为不
13、同,扩散性信号分子,跨膜蛋白的直接互作,间隙连接(gap junction),信号传导特点,传递距离有限并非所有细胞都能对某种信号发生反应。不同类型细胞可对同一信号发生不同反应,e.g.,乙酰胆碱使心肌收缩频率下降，但促使唾液腺分泌唾液。,Autonomous cell fatenon-autonomous cell fate,(六)、Patterning常涉及positional information的翻译,(六)、Patterning常涉及positional information的翻译(续),(七)、间距模式(spacing patterns)可通过侧向抑制作用产生,(八)、胞质决定
14、成分的区域化及细胞的不对称 分裂使细胞具有不同的特性,线虫的不对称卵裂产生不同命运的卵裂球,二、传统的发育生物学研究技术,染料细胞标记,荧光细胞标记,细 胞 移 植,三、控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法,基因组时代：人类基因组计划,DNA序列已经告诉了我们什么？,后基因组时代功能基因组时代,空间结构？,胞内分布及靶位？,影响器官？,基因类型？,底物？,影响途径？,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；分离时空特异性表达基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自
15、然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；分离时空特异性表达基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,隐性突变；半显性突变；显性突变,突变体的类型,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,突变类型图示,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,自然群体中的突变体；化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子利用等；X射线或 r射线照射,获得突变体的方法,斑马鱼上ENU化学突变研
16、究的成就(1996),从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,化学诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,隐性突变体的鉴定方法,化学诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,反转录病毒插入引起的突变的鉴定,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,Expression of GFP in virus-infected fish,Transient,germline,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,An example of mutational phenotypes,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发
17、育的基因,DNA插入诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,Genetic mapping and chromosomal walking；PCR or Southern hybridization；Candidate cloning；Differential display/subtractive cloning,从突变体克隆基因的方法,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；分离时空特异性表达基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,分离时空特异性表达基因的方法,获取特定组织：直接取材或转基因法取
18、材；构建cDNA文库；从蛋白质到基因；Differentiatial hybridization/differential display/subtractive cloning,分离时空特异性表达基因的方法,基因芯片/核酸杂交法,Subtractive cloning,分离时空特异性表达基因的方法,利用基因序列同源性的克隆法,用一个物种的基因直接做探针分离另一个物种的同源基因；根据多个物种的蛋白序列分离另一个物种的同源基因；根据同一基因家族的不同成员间的保守序列分离新的家族成员；,利用大分子间的相互作用克隆新的基因,鉴定可与蛋白质结合的DNA序列分离靶蛋白质，（可采用gel-shift as
19、say)克隆靶蛋白的表达基因。,利用DNA与蛋白质间的相互作用,分离时空特异性表达基因的方法,利用蛋白质之间的相互作用,酵母双杂交法,(二)、基因表达的检测,mRNA的检测蛋白质的检测启动子活性检测,(二)、基因表达的检测,mRNA的检测蛋白质的检测启动子活性检测,mRNA的检测,Northern blotDot blotRT-PCRDNA Microarrayin situ hybridization,Northern杂交的作用：检测基因的转录物的存在及是否发生了选择性拼接。,mRNA的检测,原位杂交(in situ hybridization),利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱,mRN
20、A的检测,(二)、基因表达的检测,mRNA的检测蛋白质的检测启动子活性检测,蛋白质的检测,电泳法Western blot抗体染色法,(二)、基因表达的检测,mRNA的检测蛋白质的检测启动子活性检测,启动子活性检测法,表达载体的构建：,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)异位表达法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference(RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominan
21、t interferring allele,用基因敲除法研究基因的功能,三、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)异位表达法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference(RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,转基因动物与基因的异位表达,DNA注射；RNA注射；病毒感染。,用组织特异性启动子控制外源基因的表达,绿色血液,绿色神经细
22、胞,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)异位表达法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference(RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(gene knockout)异位表达法(ectopic expression)RescueAntisense RNAAntisense oligosDsRNA interference(RNAi)Antibody blockingDominant negative receptor mutationsDominant interferring allele,Dominant Negative Receptor Mutations,细胞膜,Dominant Interferring allele,
