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1、微生物与线虫互作的分子机制,汇报内容,一、细菌与线虫互作的分子机制 1、细菌引诱线虫的分子机制 2、线虫上当趋化的分子机制 3、线虫对病原细菌免疫的分子机制二、真菌与线虫互作的分子机制 1、真菌侵染线虫的分子机制 2、线虫对真菌免疫的分子机制,背景,线虫病害已上升为农作物第二大病害全球每年损失1570亿美元,细菌再现特洛伊木马战争指挥系统？,2-庚酮，苯甲酸苄酯,苯甲醛,苯乙酮,吲哚,奈和2,5-二甲基苯甲醚,1、细菌引诱线虫的分子机制,Bacillus nematocida B16,A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis agai
2、nst nematodes_PNAS,2010,107:16631-16636,细菌与线虫,A、组织引诱的通讯系统？B、细菌中何基因负责引诱化合物的生产？,Bacillus nematocida B16 基因组基本状况,使用454和ABI联合测序方法，覆盖率17X。,QS基因的克隆-comP,comP 基因序列在NCBI中比对结果,线虫引诱剂合成酶系及其顺式作用元件,尽管B16中的大多数合成酶系在其它芽孢杆菌（包括无引诱活性的芽孢杆菌）保守，但B16与它们的顺式作用元件不同，说明调控方式可能是B16引诱剂合成的关键因素之一。,comP-comA群体感应系统下游调控的靶标基因功能分类,靶标基因数
3、目：119个,*与枯草芽孢杆菌的相比，ComP-comA系统在B16中有很大不同。,突变株是comP突变株,突变菌株吸引能力的检测,野生型B16:167 37.112.67%comP突变菌:1 0.300.25%E.coli:2 11.480.49%空白培养基:1 0.150.10%,SPME/GC-MS检测 comP突变株,野生型B16,comP,空白培养基,2-庚酮,甲基酮合成途径相关基因启动子预测的调控元件,MKS and MKSYneP,YtpA,2-庚酮的合成途径,候选基因的异源表达,YneP蛋白16.1 kD,YtpA蛋白29.5 kD,Marker,97.2,66.4,44.3,
4、29.0,20.1,14.3,2-heptanone,2-pentanone,2-hexanone,2-nonanone,2-octanone,2-undecanone,2-Decanone,SPME/GC-MS检测 候选基因表达菌株,2-heptanone RT6.828,Deng X,Tian Y,Niu Q,Xu X,Shi H,Zhang H,Liang L,Zhang K*,Huang X*.The ComP-ComA quorum system is essential for“Trojan horse”like pathogenesis in Bacillus nematocid
5、a.PloS ONE,2013,8(10):e76920.,菌株B16产生特异性信号分子：,苯甲醛,2庚酮,6甲基2庚酮,三羰基环庚三烯,2-乙基已醇,苯乙酮,2戊酮,苯甲酸苄酯.,2、线虫是如何上当的？,2、线虫是如何上当的？,线虫具有完善的化感体系，可检测挥发性、水溶性等多种化学物质，并以这些为线索，追踪食物、躲避危险，这些神经元主要集中在头部。,线虫有12对头部化感神经元,具有纤毛，纤毛结构对线虫感知环境中的化学物质是极为关键的。,1、线虫感知B16吸引的神经元,AWC:odr-1和daf-11（鸟苷酸环化酶）tax-2,tax-4（环化核苷酸离子通道）,AWA:odr-7(核激素受体)
6、,实验部分,感知信号分子的神经元,A,C,B,Benzaldehyde、2-Heptanone,AWC:,AWA:,2-ethyl,1-Hexanol,GPCR,？,己知在AWC表达的GPCR:STR-2,SRA-13,str-2突变线虫株，对2heptanone的趋化性缺陷,检测基因str-2在2庚酮存在时表达量的变化,C,D,B,A,A,C白光下线虫头部 B,无2庚酮时，基因str-2的荧光D,有2庚酮存在时，基因str-2的荧光强度实验结果说明，2庚酮可以诱导基因str-2的表达增强,G蛋白亚基,STR-2,？,ODR-3,GPA-3,EGL-30,不同G蛋白对线虫趋化性的影响,cGMP
7、 pathway,PKA pathway,PLC pathway,STR-2,2-heptanone信号转导的可能途径,G蛋白亚基ODR-3 GPA-3 EGL-30,STR-2,PKA pathway,KIN-2蛋白激酶A,PDE-1磷酸二酯酶,PKA pathway,EGL-8/PLC-1磷脂酶C,PLC pathway,ITR-1IP3受体,CMK-1钙调蛋白激酶,CAL-1钙调蛋白,TAX-2/TAX-4环化核苷酸门控的离子通道,ODR-1/DAF-11鸟苷酸环化酶,cGMPpath way,不同信号途径对线虫趋化性的影响,外源添加环化鸟苷酸对线虫趋化性的影响,通过在培养基中外源添加环
8、化鸟苷酸，基因odr-1,daf-11突变的线虫恢复了对2-庚酮的趋化性。,外源添加PLC抑制剂,外源添加在PLC抑制剂同样影响线虫对2庚酮的趋化性。,表35 单基因突变和双基因突变线虫的趋化性,图35 单基因突变和双基因突变线虫的趋化性,在gpa-3和egl-30双突变时，线虫比单突变的趋化性又有所降低，与PLC途径下游基因对趋化性的影响几乎相同；将gpa-3与PLC途径下游基因进行双突变时，线虫的趋化性与PLC下游基因单突变时相同，这说明PLC下游基因包括：egl-8,plc-1,itr-1,cmk-1,cal-1是影响线虫对2庚酮趋化性的一条主要途径。,ZK7,ZK7+B16(7:1),
9、线虫生防真菌Pochonia chlamydosporia与根际细菌协同增效机制（31260446）,3、线虫对病原细菌免疫的分子机制,Fielenbach&Antebi,Genes Dev 2008,Favorable conditions,Unfavorable conditions,DA:dafachronic acid是核受体DAF-12的配体,发育,生长停滞，长寿,D.L.Motola et al.,Cell 124,1209(2006).,-DA,胆固醇,+DA,DA,氧化应激和热激,Liganded DAF-12,Unliganded DAF-12,问题：,Gerisch et
10、al.,PNAS 2007,Favorable conditions,Unfavorable conditions,代谢,daf-9(e1406)+DA,激素 DA 对线虫抵抗病原细菌是必须的,A,D,B,C,-DA,胆固醇,+DA,DA,氧化应激和热激,Liganded DAF-12,Unliganded DAF-12,病原细菌,核受体 DAF-12 参与了线虫抵抗细菌,mir-84p:GFP,daf-9(e1406),daf-12(rh411rh61),N2+Starvation N2+PA14+PA14+PA14,mir-241p:GFP,病原细菌侵染激活了 DAF-12/DA转录活性,
11、-DA,胆固醇,+DA,DA,氧化应激和热激,Liganded DAF-12,Unliganded DAF-12,病原细菌,核受体DAF-12/DA是通过抑制OCTR-1功能来促进免疫,714,1125,277,OCTR-1(down),DAF-12/DAs(up),Sun et al.Science,2011,OCTR-1:octopamine G proteincoupled receptor,N2+Starvation N2+PA14+PA14+PA14,daf-9(e1406),daf-12(rh411rh61),octr-1+OA,核受体DAF-12/DA抑制OCTR-1的配体章鱼胺
12、,TBH-1：章鱼胺合成的限速酶,DA,DAF-9,DIN-1,Stress,DAF-12,结论：我们表明一条参与代谢的激素信号途径可以用于抵抗病原菌，揭示线虫也存在代谢与免疫偶联的现象。,DAF-12,Food,Metabolism,二、真菌与线虫互作的分子机制1、真菌的侵染机制,Part 2.Genome projects of other nematophagous fungi,Statistics of shotgun sequencing,Statistics of genome features,Gene prediction,Phylogenomics analysis usin
13、g orthologous genes,Distributions of nematophagous-fungi-shared-genes,Shared genes of nematophagous-fungi,Shared genes of nematophagous-fungi with PHI-base hits,Enrichment analyses of shared genes of nematophagous-fungi,RNA-seq,Significantly changed genes,Dactylella tenuis 1603,Dactylellina entomopa
14、ga 1157,Arthrobotrys oligospora 1448,Drechslerella brochopaga1273,SHARED24,24 shared genes 3 genes in Dactylella tenuis=21 SHARED genes,Enrichment analyses of shared genes,Functions and gene families,Enrichment analyses of shared genes,Pathway and categories,二、真菌与线虫互作的分子机制2、线虫对真菌侵染的免疫机制,Drechmeria c
15、oniospora,Clonostachys rosea,沉默DAF-16导致线虫对真菌抵抗减弱，与细菌完全不同,Garsin et al.Science 2003,Pseudomonas aeruginosa infection,0 h 12 h 24 h,细菌侵染线虫不激活DAF-16,圆锥掘氏梅里霉（Drechmeria coniospora）,C.rosea,0 h 12 h 24 h 12h,相反，真菌侵染线虫激活DAF-16,263,1533,48,D.coniospora,A,B,C,PA14,N2,Spiny balls,D.Coniospora(up),DAF-16,S.au
16、reus,C.rosea,D.coniospora,N2,C.rosea,Spiny balls,PA14,S.aureus,Plys-7:GFP,D,Figure 1 DAF-16 is activated by funal infection and physical injury,Murphy et al.,2003,Nature,277-283,Engelmann et al.,2011,PLoS One,DAF-16,ROS,FOXO3a,哺乳动物 线虫,Lehtinen et al.Cell 2006,抗氧化基因,问题：DAF-16如何被真菌激活？,Mammalian Ste20-
17、like kinases-1,Dual oxidase(DUOX),？,A,B,C,D,N2+vector+vector+DC,+DC+duox-1 RNAi,+vector+SB,+SB+duox-1 RNAi,N2+vector+vector+DC,+DC+duox-1 RNAi,+SB+duox-1 RNAi,E,N2 D.coniospora C.rosea,PA14 S.aureus Spiny balls,+vector+SB,Figure 3 Epidermal DUOX-1-mediated ROS formation plays a crucial role in the d
18、af-16 nuclear accumulation,DHE,Niethammer et al.,2009,Nature,受伤时，偶联氧化酶介导ROS产生,D.coniospora,Spiny balls,DAF-16,ROS,FOXO3a,哺乳动物 线虫,Lehtinen et al.Cell 2006,抗氧化基因,问题：DAF-16如何被真菌激活？,Mammalian Ste20-like kinases-1,Dual oxidase(DUOX),？,A,B,C,E,D,N2+vector+vector+DC,+DC+cst-1 RNAi,+vector+SB,+SB+cst-1 RNAi
19、,Figure 4 CST regulates the nuclear accumulation of DAF-16,DAF-16,ROS,FOXO3a,哺乳动物 线虫,Lehtinen et al.Cell 2006,抗氧化基因,问题：DAF-16如何被真菌激活？,Mammalian Ste20-like kinases-1,Dual oxidase(DUOX),？,A,N2 DC,+DC+IP3 sponges,SB,N2 DC,+DC+itr-1 RNAi,SB,+SB+IP3 sponges,+SB+itr-1 RNAi,B,C,D,E,N2 DC,+DC+itr-1 RNAi,+DC
20、+IP3 sponges,+DC+itr-1 RNAi,+SB+IP3 sponges,+SB+itr-1 RNAi,+DC+IP3 sponges,Figure 5 IP3-ITR-1/Ca2+regulates daf-16 nuclear accumulation,EGL-30-EGL-8-IP3-ITR-1 Ca2+Xu,2011,Curr Biol:3072-3082,Ca2+sensor GCaMP3,A,B,C,N2 DC SB,+DCegl-30(n686),+SBegl-30(n686),+DC egl-8(n488),+SB egl-8(n488),D,N2 DC SB,+
21、DCegl-30(n686),+DC egl-8(n488),+SBegl-30(n686),+SB egl-8(n488),Figure 6 egl-30 and egl-8 is required for regulate daf-16 nuclear accumulation,Fig.7,A proposed mechanism by which DAF-16 is activated by fungal infection or physical injury,PLoS Pathogens 9(10):e1003660,Dr.Joan W.Bennett at Rutgers Univ
22、ersity,USADr.An Zhiqiang at University of Texas Health Science Center,USADr.Frederick M.Ausubel at Harvard Medical School,USA,陶俊 李玉宏,张春媚,田宝玉 牛秋红,线虫细菌,基因,三、细菌、真菌、线虫互作机制,真菌,牛粪中细菌的分离,细菌中活性化合物的分离,三、真菌、细菌、线虫三者互作的机制,细菌为什么要调控另一生物的发育？,牛粪中共分离得到271株细菌,诱导活性菌株广泛分布在Pseudomonas aeruginosa，Bacillus thuringgiensis，
23、B.cercus Leucobacter komagatae，B.amyloliquefaciens/B.Subtilis，Proteus vulgaris，Stenotrophomonas sp.，Pseudochrobactrum sp.，Arthrobacter sp.，Proteus.valgaris/swine manure，Rhodobacter bacterium，Alcaligenes faecalis，B.fusiforms/lysinibacillius sp.，Serratia sp.线虫分离体表菌群，线虫肠道菌群有诱导活性，菌群以stenotrophomonas sp.
24、，Rhodobacter sp.和staphylococcus sp.为优势群体,化合物Urea广泛存在活性菌株中,化合物Urea合成基因在NCBI中广泛检索到,在食线虫真菌ATCC24927中定位相应通道蛋白基因,敲出相应基因（正在进行）,细菌调控另一生物的发育是否具有普遍性？,三角瓶中加入2g灭活土壤，分别加入细菌CD52和线虫实验进行了两组，线虫浓度为1200条/ml，加入1mL,只加细菌CD52的情况 线虫增殖,2g灭活土壤，分别加入A.o，线虫（1200条/ml）1ml，,6d后统计不到线虫,细菌对线虫作用,真菌对线虫作用,细菌，线虫，真菌三者作用,数据分析：（1）A.o+CD52+Ce组中Trap产生的时间提前，捕食线虫的时间提前；（2）A.o+CD52+Ce组中线虫全部死亡的时间提前,调控的目的何在？,线虫细菌,基因,三、细菌、真菌、线虫互作机制,真菌,A,B,C,D,E,Fig.2 DAF-16 in the epidermis is required in immune response to fungal infection and physical injury,D.coniospora,C.rosea,spiny balls,D.coniospora,spiny balls,
