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1、微生物的鉴定,微生物的鉴定,实验3-1 微生物的形态观察实验3-2 细菌特殊结构的观察实验3-3 革兰氏染色法实验3-4 微生物大小测定与计数实验3-5 微生物的理化性能鉴定,实验3-1 微生物的形态观察,一、实验目的1.学习微生物涂片、染色的基本技术。2.掌握微生物的简单染色法。3.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理 微生物的细胞小而透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须借助于染色,使菌体着色以增加菌体的显示力,从而更清楚地观察到其形态和结构。,实验3-1 微生物的形态观察,在微生物形态观察中,根据不同的种类,需采用不同的染液和染色方法。染色前必须固定微生物,其目
2、的有二:一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上;二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法,固定时应尽量维持细胞的原有形态,防止细胞膨胀或收缩。,实验3-1 微生物的形态观察,三、实验材料1.菌种与染料 根据不同的菌种采用不同的染液,见表3-1和附录。2.仪器和其他用品 显微镜,接种环,解剖刀,镊子,酒精灯,载玻片,盖玻片,石蜡油,吸水纸,擦镜纸。,表3-1 不同微生物种类所使用的染液,实验3-1 微生物的形态观察,四、实验方法(一)细菌、酵母菌的染色 染色操作程序为:涂片干燥固定染色水洗干燥油镜观察。1.涂片 取干净载玻片,于中央加蒸馏水一小滴,将接种环在火焰上灼烧灭菌,冷却后,
3、取试管斜面一支,按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基),涂在载玻片水滴中,涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水,直接取菌液12环涂片,接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。,实验3-1 微生物的形态观察,图3-1 无菌操作及做涂片的过程,实验3-1 微生物的形态观察,2.干燥 将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干,但不能直接在火焰上烘烤,以免菌体变形。3.固定 手执涂片一端,有菌膜的一面向上,迅速通过火焰23次,使菌体固定于载玻片上,待载玻片冷却后,再加染料。4.染色 将涂片置于玻片搁架上,加适量(以盖满菌膜为度
4、)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位,染色12分钟。5.水洗 倾去染色液,用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗,至流下的水中无染色液的颜色时为止。6.干燥和镜检 让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。,实验3-1 微生物的形态观察,(二)放线菌、霉菌的染色1.制片及染色 用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝,置于载玻片中央,先用另一载玻片使劲挤压有菌部分,使得菌群铺成一薄层,然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热,使培养基融化,冷却后,在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液,再轻轻盖上盖玻片,注意避免产生气泡。
5、2.镜检 先用低倍镜观察,再换高倍镜观察。五、实验报告 绘出所观察到的各种微生物的形态。,返回,实验3-2 细菌特殊结构的观察,一、实验目的1.掌握芽孢染色的方法;2.学习并初步掌握鞭毛染色法,观察细菌鞭毛的形态特征;3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁,透性低,着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的:采用一着色力强的染料,并用微火加热,使菌体和芽孢同时着色后再用水洗,使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,细菌的鞭毛极细,其直径通常为1020nm,只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛,必
6、须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理,使媒染剂沉积在鞭毛上,鞭毛直径加粗,然后再进行染色。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质,其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽,荚膜与染料之间的亲和力弱,不易着色,且可溶于水,易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好,一些染料可透过荚膜而使菌体着色,故常采用负染色法,使菌体和背景着色,荚膜不着色;因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄,含水量又高(90%以上),故染色时不用热固定,以免荚膜皱缩变形。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,三、实验材料1.菌种 根据观察目的的不同,选用不同的实验菌种,见表3-2。2.染料及试剂 孔雀绿染色液,硝酸银鞭毛染色
7、液,黑色素水溶液(见附录),番红溶液,甲醇。3.仪器和用品 显微镜,木夹子,载玻片,酒精灯等。,表3-2 细菌特殊结构观察所选用的菌种,实验3-2 细菌特殊结构的观察,四、实验方法(一)芽孢的染色1.涂片 取培养24h左右的枯草杆菌,涂片、干燥、固定。2.初染 加35滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上,用木夹夹住载玻片,用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间,约维持5min。加热中应随时注意补加染液,切勿使标本干涸。3.水洗 待玻片冷却后倾去染液,水洗至不再褪色为止。4.复染 加番红液1滴,染色1min,水洗。5.镜检 干燥后用油镜观察。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,(二)鞭毛染色1.菌种的准备
8、 冰箱保存的菌种要连续移种12次,取新配制的营养琼脂斜面接种,2832培养1014h。2.载玻片的准备 玻片要求光滑,洁净,忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min,取出用清水充分洗净,沥干水后置于95%乙醇中,用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。3.菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有12 mL无菌水的试管中,制成轻度混浊的菌悬液用于制片。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,4.制片 取一滴菌液于载玻片的一端,然后将玻片倾斜,使菌液缓缓流向另一端,用吸水纸吸去玻片下端多余菌液,室温(或37温箱)自然干燥。5.染色 涂片干燥后,滴加硝酸银染色A液覆盖35 min,用蒸
9、馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后,再加B液覆盖涂片染色约数秒至1 min,当涂面出现明显褐色时,立即用蒸馏水冲洗。6.镜检 干后用油镜观察。菌体呈深褐色,鞭毛显褐色,通常呈波浪形。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,(三)荚膜染色1.制片 在载玻片一端加一滴无菌水溶液,取少许培养72h的褐球固氮菌,在水滴中制成菌悬液,取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片,将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方,使其涂成一薄膜,风干。2.固定 用纯甲醇浸没涂片,固定1min,立即倾去甲醇,文火干燥,勿使玻片发热。3.染色 滴加番红溶液,染色12min,细水流适当冲洗,自
10、然干燥。4.镜检 背景黑灰色,荚膜呈一清晰透明圈,菌体红色。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,五、实验报告1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。,返回,实验3-3 革兰氏染色法,一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理。2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色,故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同,可将细菌分为两大类,菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌,呈红色者为革兰氏阴性菌。,实验3-3 革兰氏
11、染色法,其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚,交联度大,类脂质含量低,经用乙醇(或丙酮)脱色等处理主要发生脱水作用,而使孔径缩小,通透性降低,初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色,结果使细胞呈紫色;而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄,类脂含量高,当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁通透性增大,使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来,用番红复染后,细胞被染上红色。,实验3-3 革兰氏染色法,三、实验材料1.菌种 大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。2.染料和器材 显微镜,载玻片,草酸铵结晶紫染色液,卢戈氏碘液(见附录),95%乙醇,番红染液,香
12、柏油,二甲苯,擦镜纸。,实验3-3 革兰氏染色法,四、实验方法 1.涂片 挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法:在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水,先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后,再将左右方的菌液延伸于中间区,使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。2.干燥 室温自然干燥。3.固定 涂面朝上,在火焰上过23次。,实验3-3 革兰氏染色法,4.染色(图3-3)(1)初染 加草酸铵结晶紫染色液一滴,染色12 min,水洗。(2)媒染 滴加卢戈氏碘液冲去残水,覆盖约1min,水洗。(3)脱色 斜置玻片于一烧杯上方,并在载玻片背
13、面衬一白纸,滴加95%乙醇脱色,并轻轻摇动载玻片,直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5 min)。立即用水洗净乙醇,并轻轻吸干。(4)复染 加番红染液一滴染色2min,水洗。,实验3-3 革兰氏染色法,实验图3-3 革兰氏染色程序,1.加草酸铵结晶紫染12分钟;2.水洗;3.加碘液媒染1分钟;4.水洗;5.乙醇脱色约30s;6.水洗;7.番红复染约2分钟;8.水洗。,实验3-3 革兰氏染色法,5.干燥 先用吸水纸轻轻吸干,再晾干。6.镜检 先用低倍镜找到物像后,用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告 简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图(说明各菌的形
14、态、颜色和革兰氏染色反应)。,返回,实验3-4 微生物的大小测定与计数,一、实验目的1.了解用测微尺测定微生物大小的方法;2.了解血球计数板的结构,掌握使用和计算方法。二、实验原理 微生物细胞的大小,是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小,只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形的玻片,在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,测量时,将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而异。即目镜测微尺
15、上的刻度只是代表相对长度,所以在使用前须用镜台测微尺校正,以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚),其上镶有一圆形玻片,其中lmm的刻度被精确等分为100小格,每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变,所以用镜台测微尺的已知长度,在一定放大倍数下,即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-2目镜测微尺 图3-3镜台测微尺 图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况,实验3-4 微生物的大小测定与计数,血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数板是一块特制的载
16、玻片,玻片上有4条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm,每个平台上刻有不同规格的格网,中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-5 血球计数板的构造,1-盖玻片 2-计数室,实验3-4 微生物的大小测定与计数,血球计数板有两种规格,一种是将lmm2面积分为25个大格,每个大格再分为16个小格(2516)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a),其含义是:XB-K-25为计数板的型号和规格,表示此计数板分25大格:即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高;(1/400)mm2表示计数室面积是lm
17、m2,分400个小格,每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格,每个大格再分为25个小格(1625)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上,从两个平台侧面加入菌液后,400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计,可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-6 两种不同刻度血球计数板的构造,实验3-4 微生物的大小测定与计数,三、实验材料1.标本 酿酒酵母,枯草杆菌染色标本片。2.仪器和用品 显微镜,目镜测微尺,镜台测微尺,血球计数板,移液管,香柏油,二甲苯
18、,盖玻片,擦镜纸等。四、实验方法(一)微生物大小的测定1.目镜测微尺的校正(1)将目测微尺装入目镜的隔板上,使刻度朝下;(2)把物测微尺放在载物台上,使刻度朝上,对准聚光器。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,(3)先用低倍镜观察,对准焦距,视野中看清镜台测微尺的刻度后转换高倍镜,再次调焦看清镜台测微尺的刻度后,转动目镜,使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行,移动推动器,使两尺的第一条线重合,顺着刻度找出另一条重合线。(4)记录两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有若干格。各种放大倍数各测量3次,取其平均值。(5)因为镜台测微尺的刻度每格10m,所以由下式计算出用低倍镜、高倍镜和油镜观察物体
19、时,目镜测微尺每格的实际长度。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,(6)移去镜台测微尺,并将其洗净、晾干,放回盒内。例如,目镜测微尺5小格等于镜台测微尺2小格,则目镜测微尺上每小格长度为:2105=4m 用同法校正在油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行,而且只能在特定的情况下重复使用。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,2.菌体细胞大小测定(1)取一张干净的载玻片,滴上一滴棉兰染色液或路戈氏碘液。(2)用接种环无菌操作取酵母菌少许制成水浸标本片。(3)取下镜台测微尺,换上酵母菌
20、水浸片,先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格(不足1格的部分估计到小数点后l位数)。测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度即等于该菌的大小。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,一般测量菌体的大小要在同一涂片上测定1015个菌体,求出平均值,才能代表该菌的大小,而且是用对数生长期的菌体进行测定。3.用同法在油镜下测定枯草杆菌染色标本的长和宽。4.用毕后,取出目镜测微尺,将目镜放回镜筒,用擦镜纸擦去目镜测尺的油腻和手印,擦好油镜头。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,(二)微生物的计数1.稀释样品,为了便于计数,将样品适当稀释,使每格约含45 个细
21、胞。2.取干净的血球计数板,用厚盖玻片盖住中央的计数室,用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘,菌液则自行渗入计数室,静置5 10min 即可计数。3.将血球计数板置于载物台上,用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动微调节器,以便看到计数室内不同深度的菌体。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,现以1625 规格的计数板为例,数四个角(左上、右上、左下、右下)的四中格(即100 小格)的酵母菌数。如果是2516 规格的计数板,除取四个角上四中格外,还取正中的一个中格(即80 小格),对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌,或只计下方及右方线上的酵母
22、菌。每个样品重复计数3 次,取平均值,再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌数。酵母菌细胞数/mL=每个小格内细胞数400104稀释倍数,实验3-4 微生物的大小测定与计数,五、实验报告1.将实验结果填入下列空格目镜_倍,低倍镜_倍,高倍镜_ _,油镜 倍。高倍镜下,目镜测微尺_格:镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。油镜下,目镜测微尺_格镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。2.将测得的菌体大小记录于下表3-3中3.将计数得的菌体数量记录于下表3-4中,实验3-4 微生物的大小测定与计数,表3-3 菌体大小测量结果,表3-4 菌液中所含的酵母菌数,返回,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,一、
23、实验目的1.了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。2.了解不同种类的细菌对碳水化合物及含氮化合物的分解利用情况,从而认识微生物代谢类型的多样性。3.学习平板接种法及穿刺接种法。二、实验原理 由于各种微生物的新陈代谢不同,因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同,故可利用化学反应来测定微生物的代谢物(这种反应称为生化反应),并以此作为鉴定微生物的依据。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,三、实验材料1.菌种 枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,产气杆菌,普通变形杆菌。2.培养基 淀粉培养基,葡萄糖蛋白胨培养基,蛋白胨水培养基,柠檬酸铁铵固体培养基等,见附录。3.试剂 卢戈氏碘液,40%NaOH溶液,5%-
24、萘酚溶液(乙醇配制),甲基红试剂,吲哚试剂(见附录),乙醚等。4.其他物品 无菌培养皿,无菌试管,接种环,酒精灯,接种针等。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,四、实验方法(一)淀粉水解试验 某些细菌可以产生淀粉酶(胞外酶),使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,再被细菌吸收利用,淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下:1.将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水俗中融化,然后取出冷却至50左右,以无菌操作倾入培养皿中约1520mL,待凝固后制成平板。2.翻转平皿使皿底朝上,用记号笔在其背面做好标记,以免菌种混淆。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,3.用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“+”字作为阳性对
25、照菌;另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板的另一边划“+”字(图3-7),然后将培养皿倒置于37恒温箱中培养24h。4.观察结果 打开培养皿盖,滴加少量碘液于平板上,轻轻旋转,使碘液均匀铺满整个平板,如菌体周围出现无色透明圈,则说明淀粉已被水解。透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的强弱。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(二)乙酰甲基甲醇(V.P.)试验 某些细菌在糖代谢过程中,能分解葡萄糖产生丙酮酸,二个分子丙酮酸经缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下,被氧化成二乙酰,二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基起作用,生成红色化合物。此为V.P.试验的阳性反
26、应。在试管中加入少量的-萘酚为颜色增强剂可使反应加快。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,操作步骤如下:1.分别接种大肠杆菌和产气杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养基的试管中,置于37恒温箱内培养2448h,有时需延长培养到10天。2.在已培养两天的试管内,先加入40%KOH溶液1020滴,然后再加入等量的-萘酚溶液,拔去棉塞用力振荡,再放入37恒温箱中保温1530min(或在沸水浴中加热12min)。如培养液出现红色为V.P.阳性反应。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(三)甲基红(M.R.)试验 有些细菌在糖代谢过程中,可把培养基中的糖分解为丙酮酸,丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可
27、由加入甲基红指示剂的变色而指示。甲基红的变色范围pH4.2(红色)pH6.3(黄色)。操作步骤如下:1.取葡萄糖蛋白胨培养液两支,一支接入大肠杆菌,另一支接入产气杆菌,置37恒温箱内培养48h。2.观察结果时,沿管壁加入甲基红指示剂34滴,若培养液变红色即为阳性,变黄色则为阴性。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(四)吲哚试验 有些细菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚,吲哚无色,可与对二甲基氨基苯甲醛结合,生成红色的玫瑰吲哚。操作步骤如下:1.以无菌操作分别将产气杆菌和大肠杆菌接种在蛋白胨水培养中,置37恒温箱内培养48h。2.观察结果时,在培养液中加入乙醚12mL(使呈明显的乙醚层),
28、充分振荡,使吲哚被溶于乙醚中,静置片刻,使乙醚层浮于培养基的上层,然后沿试管壁加入10滴吲哚试剂,如果有吲哚产生,则乙醚层呈现玫瑰红色。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(五)H2S产生试验 某些细菌能分解含硫有机物,如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等,会形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。操作步骤如下:1.取2支柠檬酸铁铵固体培养基,分别用穿刺接种大肠杆菌和普通变形杆菌,置37恒温箱内培养48h。2.观察结果,如培养基中出现黑色沉淀线者为阳性反应,同时注意观察接种线周围有无向外扩展情况,如有表示该菌具有运动能力。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,五、实验报告 将实验结果填入下表3-5。“”表示阳性反应,“”表示阴性反应。,表3-5 微生物的理化性能鉴定结果,