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1、第四章 微生物的生理,41 微生物的酶,微生物的营养和代谢需在酶的参与下才能正常进行。哪里有生命现象哪里就有酶的作用。,（一）定义：酶(enzyme)是由活性细胞产生的具有催化性、专一性的一种特殊蛋白质，是动物、植物和微生物等生物体内合成、催化生化反应，并传递电子、原子和化学基团的生物催化剂。,一、酶的定义和组成,（二）组成,辅助因子,辅酶（cofactor,coenzyme),辅基(prosthetic group),激活剂,：主要是金属离子,（三）酶的各个组分的功能：,酶蛋白：加速生物化学反应的作用，决定了催化反应作用的底物类型（反应的专一性)。,辅酶和辅基：决定了催化反应的性质，传递电子
2、、原子或化学基团，其中的金属离子还起激活剂的作用。（参见课本P101）,激活剂：主要作用是使酶蛋白或基质保持一定的构型，有利于化学反应的完成，但并不直接参加。,辅基和辅酶的区别在于它们与酶蛋白的结合牢固程度不同。与酶蛋白结合得牢，用透析法分不开的叫辅基；与酶蛋白结合得不牢，用透析法可以分开的叫辅酶。,对于全酶，酶蛋白自身没有催化活性，只有与辅助因子结合才具有催化作用,二、酶的分类与命名,(一)酶的分类,()按照酶所催化的化学反应类型，把酶划分为6类：水解酶类、氧化还原酶类、异构酶类、转移酶类、裂解酶类和合成酶类。,()按酶在细胞的不同部位，可把酶分为胞外酶、胞内酶和表面酶。,()按酶作用底物的
3、不同，可把酶分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、核糖核酸酶。,1、水解酶类：是催化大分子有机物水解成小分子的酶。反应通式为：,2、氧化还原酶类：催化氧化还原反应的酶。反应通式为：,式中AH2为供氢体，B为受氢体。,(1)氧化酶类：氧化酶催化的反应有两种结果：催化底物脱氢，氢由辅酶（FAD或FMN）传递给活化的氧，两者结合形成H2O2，反应通式如下：,催化底物脱氢，活化的氧和氢结合生成H2O，反应通式为：,(2)脱氢酶类；催化底物脱氢，氢由中间受体NAD接受。如乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。,3、转移酶类：催化底物的基团转移到另一有机物上的酶。其通式为：,式中的R是被转移的基团：氨基、醛基、酮基、
4、磷酸基等。,4、异构酶类：催化同分异构分子内的基团重新排列。反应通式为：,5、裂解酶类：催化有机物裂解为几个分子较小的有机物，其通式为：,6、合成酶类：催化底物的合成反应。蛋白质、核酸的生物合成都需要合成酶参与，需要消耗ATP以获取能量。反应通式为：,(二)酶的命名,1、系统命名法：底物名+催化反应类型+“酶”如葡萄糖异构酶：催化葡萄糖转化为果糖。,谷丙转氨酶：催化谷氨酸的氨基转移到丙酮酸上成为丙氨酸和-酮戊二酸。,底物为名：淀粉酶、蛋白酶等。催化反应类型：合成酶、裂解酶等。,2、习惯命名法,三、酶蛋白的结构,酶蛋白具有-螺旋或片状的复杂空间结构。由20种氨基酸按一定顺序以肽键（CONH）连接
5、成多肽链，两条多肽链之间或一条多肽链卷曲后相邻的基团之间以氢键()、二硫键(SS)、盐键（-NH3+-OOC-）、酯键（RCOOR）、疏水键、范德华力及金属键等相连接而成。,酶蛋白的结构分一级、二级和三级结构，少数酶具有四级结构。,(1)一级结构：指多肽链本身的结构。,(2)二级结构：由多肽链形成的初级空间结构，由氢键维持其稳定性。氢键受到破坏时，其紧密的空间结构变得松散，多肽链展开，酶蛋白即变性。,(3)三级结构：是在二级结构基础上，多肽链进一步弯曲盘绕形成更复杂的构型。由氢键、盐键及疏水键等维持三级结构的稳定性。,(4)四级结构：由几个或几十个亚基形成。亚基是由一条或几条多肽链在三级结构基
6、础上形成的小单位。亚基之间也以氢键、盐键、疏水键和范德华力等相连，从而稳定结构。,对蛋白质分子的二级、三级结构，只考虑到是由一条多肽链卷曲而成的蛋白质。大多数酶蛋白只有一条多肽链，只具有一条多肽链的酶蛋白有三级结构，仅少数酶蛋白具有四级结构。,四、酶的活性中心,酶的活性中心是指酶蛋白分子中与底物结合，并直接起催化作用的小部分氨基酸微区。,构成活性中心的微区或处在同一条肽链的不同部位，或处在不同肽链上；在多肽链盘曲成一定空间构型时，它们按一定位置靠近在一起，形成特定的酶活性中心，见右图。,酶的活性中心分为结合部位和催化部位，两个部位各有其作用。结合部位：直接与底物结合，决定反应的专一性。催化部位
7、：参与酶的催化反应，决定反应性质。酶的活性中心对催化作用至关重要，但其他部位也很重要，它们在维持酶的空间构型、保持酶的活性中心和催化作用等方面都起着不同程度的作用。,五、酶的催化特性,（一）：具有一般催化剂的特点：用量少，催化效率高；仅改变化学反应速度，不改变反应的平衡点；酶的本身在反应前后不变；降低反应活化能。,（二）：特性1、高度专一性：一种酶只能作用于某一类；某一种特定的物质或催化某一类化学反应，产生一定的产物，酶所作用的物质称为该酶的底物或基质。绝对专一性：一种酶只作用一种物质；催化一种反应，如麦芽酶只能使葡萄糖茸键断裂，不能使葡萄糖茸键断裂。相对专一性：一种酶只能作用于一类化合物，该
8、类化合物具有相同的化学键或基团。如蛋白酶只能水解肽键（-CO-NH-），因此可水解许多蛋白质。,立体专一性：只能对某一种含有不对称碳原子异构体起催化作用，而不能催化它的另一种异构体。,2、催化条件温和，易失活，只需在常温常压下进行，而在强酸强碱高温条件下会使酶破坏而失活，对环境条件极为敏感。,3、催化效率高：比一般催化剂高几千至百亿倍。,六、酶的催化机制,酶与底物结合完成催化反应的机制目前有两种假说：钥匙学说和诱导契合学说,钥匙学说：酶与底物结合时，二者必须吻合，若结构稍有改变，则催化反应将不能进行。该学说可以解释酶对底物的专一性。,诱导契合学说：认为酶的活性中心构象柔韧可变，二者结合之前并非
9、恰巧吻合，只有当酶与底物结合时，诱导中心因受底物诱导，其构象与底物配合，形成复合物。酶完成催化反应后随即恢复原有构象。,七、酶促反应动力学,1、研究对象：研究酶反应速度及影响酶反应速度的各种因素的科学。,2、酶促反应：包括底物（S）与酶（E）结合成中间络合物（ES），ES再分解成E和产物P。酶促反应一般为可逆反应，所以ES还可以分解成E和S。,3、酶促反应动力学方程米门氏方程,大约在1913年由Michaclis and Menten 两人根据中间产物理论提出了表明底物浓度与反应速度的定量关系数学式，即米门氏方程：,(修正后的)米-门方程,式中：-酶促反应速度：指单位时间内底物被 分解量，指反
10、应的初速度。km-米氏常数，表示反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。,Km的特点：是酶的重要特征常数，酶不同，Km值不同，与酶的浓度无关；底物不同，Km值不同，Km最小的底物为最适底物；Km可近似判断酶与底物的亲和力大小，Km越小，其亲和力越大，即达到max/2时所需底物浓度就越小，易达到最大反应速度。Km受T和PH影响较大，其测定需在特定的T和PH条件下进行；Km的求解-双倒数作图法（参见教材P114）,八、影响酶活力的因素,一定条件下，酶所催化反应的反应速度，称为酶活力。,(一)酶的活力单位,国际生化协会决定用国际单位（IU）表示酶的活力。即在温度25，最适pH值，最适的缓冲溶液和最佳
11、底物浓度诸条件下，每分钟能使1微摩尔底物转化的酶量定为一个酶活力单位。,1972国际生化和分子生物学联合会酶学委员会推荐了一个新的酶活力单位“催量”,即Katal,简称 kat.,1Kat 的定义:在最适条件下,每秒钟内催化1mol/L 底物转化为产物所需的酶量定为1Kat。,在酶学研究和生产中常用酶比活力，其含义是：固定条件下，每毫克或每毫升酶液所具有的酶活力。,1Kat=6107,1、酶的浓度对酶促反应速度的影响,由米-门公式可见，酶促反应速度与酶分子浓度成正比。当底物分子浓度足够多时，酶分子越多，底物转化的速度越快。,但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系，曲线逐渐折成平缓，见右图。
12、这可能是由于高浓度的底物夹带有较多的抑制剂所致。,2、底物浓度对酶促反应速度的影响,生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的初始浓度S0较低时，酶促反应速度随S的增加而增加【但不是线性关系！】。当所有的酶与底物结合生产ES后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度ES也不会增加，酶促反应速度也不增加。,S相同条件下，酶促反应速度V与酶的初始浓度E0成正比。,3、温度对酶促反应速度的影响,各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。各种生物酶的最适温度不同。动物组织中各种酶的最适温度一般在3740；微生物的最适温度一般在2560；有的酶最适温度在60以上。一般，温度过高，大部分酶被破坏，发生不可
13、逆变性，甚至催化作用完全停止。低温(0或更低些)可降低酶的活性，但不会使酶失去活性，当提高到合适温度酶就会恢复活性，有些酶经低温处理后活性反而有所提高。,4、pH对酶促反应速度的影响,酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH值，都会降低酶的活性。pH值对酶活力的影响主要表现在两个方面：引起底物分子和酶分子的带电状态的改变，从而影响酶和底物的结合；过高、过低的pH值都会影响酶的稳定性，进而遭到不可逆性的破坏。,5、激活剂对酶促反应速度的影响,许多酶促反应只有当某一种适当的物质存在时，才表现出酶的催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂的种类很多
14、，包括无机阳离子、无机阴离子和有机化合物，详见P117-118。,6、抑制剂对酶促反应速度的影响,能减弱、抑制甚至破坏酶作用的物质，叫酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子(如，Ag+、Cu2+、Hg2+)、CO、H2S、HCN、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。,42 微生物的营养,一、新陈代谢,新陈代谢：微生物从外界环境中不断地摄取营养物质，经过一系列的生物化学反应，转变成细胞的组分，同时产生废物并排泄到体外，这个过程称为新陈代谢（简称代谢）。,同化作用和异化作用相辅相成：异化作用为同化作用提供物质基础和能量。同化作
15、用为异化作用提供基质。,二、微生物的化学组成,微生物机体质量,水分：7090,干物质：1030,从不同微生物细胞成分分析可知（教材表4-5、4-6）微生物细胞与其它生物细胞化学组成相似，常见元素为：C、H、O、N、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Co、Zn和Mo等。其中C、H、O、N占细胞干重90-97%，碳占干重50%左右，C：H：O：N=5：8：2：1。这些元素结合成水，有机物及无机盐。水是细胞的主要成分，含量大。占70-90%,有机物蛋白质、核酸、糖、类脂和维生素等。蛋白质是微生物细胞的主要结构成分及生物催化剂-酶的组成成分。核酸是微生物遗传变异的基础；糖类物质既是细胞的结构
16、成分又是能量来源；类脂参与细胞结构并作为储藏物质；维生素是各种酶的辅基。无机物多数以元素形式组成有机物，少数游离在细胞中,三、微生物的营养,微生物需要的营养物质有水、碳源、氮源、无机盐及生长因子。,(一)水,生理作用：(1)良好的溶剂，能将多种物质溶解，有利于微生物对营养的吸收和利用；(2)水是渗透、分泌、排泄的重要场所；(3)微生物的新陈代谢每步反应必须有水的参与；(4)有利于散热，调节细胞温度。,(二)碳源和能源(carbon source and energy source),简单的无机碳化合物到复杂的有机碳化合物，都可作为碳源。微生物最好的碳源是糖类，尤其是葡萄糖、蔗糖；少数微生物还能
17、以CO2或CO32中的碳素为唯一的或主要的碳源。,1、碳源：凡能供给微生物碳素营养的物质，称为碳源。,2、碳源的作用,组成微生物细胞的含碳物质（碳架）和供给微生物生长、繁殖及运动所需要的能量。,组成细胞结构作为代谢产物及细胞内贮藏物质的主要原料为微生物的生命活动提供能量，即碳源物质通常 也是机体生长的能源物质,机体能够利用的碳素化合物分为两类：,其中糖类是微生物最好的碳源，尤其是葡萄糖和蔗糖。,(三)氮源(nitrogen source),1、氮源：凡是能够供给微生物氮素营养的物质称为氮源。氮源有N2、NH3、尿素、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、氨基酸和蛋白质等。,2、作用：提供微生物合成蛋白质和核
18、酸的原料。,根据氮源要求不同，可将微生物分成四类：,固氮微生物利用无机氮为氮源的微生物利用有机氮为氮源的微生物：以氨基酸或分解蛋 白质取得氮盐或氨基酸,（四）无机盐(mineral salts),构成细胞组分，维持细胞结构稳定性（P、S、Ca、Mg、Fe等）；构成酶的组分和维持酶的活性(酶的激活剂Mg2+等)；调节渗透压（Na+等）、pH的稳定和氧化还原电位等；供给(化能)自养微生物的能源（S0、Fe2+、NH+、NO2等）,1、生理功能,大量元素（macroelements）：生长所需浓度在10-310-4mol/L范围内的元素，如P、S、Mg、Fe、Na、Ca、K等；,2、大量元素和微量元
19、素,微量元素（microelements）：生长所需浓度在10-610-8mol/L范围内的元素，如Cu、Zn、Co、Mo、Mn、Ni、Sn、Se等。,（五）生长因素/子(growth factor),生长因子是一类调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的C、N源自行合成的有机物。,由于它没有能源和C、N源等结构材料的功能，因此需要量一般很少。广义的生长因子除维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4C6的分支或直链脂肪酸等；狭义的生长因子一般仅指维生素。,在配制培养基时，一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要，例如酵母膏(yeast extract)、玉
20、米浆（cornsteep liquor,一种浸制玉米以制取淀粉后产生的副产品），肝浸液（liver infusion）、麦芽汁（malt extract）或其它新鲜动、植物的汁液等。,四、碳氮磷比,污水生物处理中好氧微生物群体（活性污泥）要求C、N、P比为BOD5:N:P100:5:1；厌氧消化污泥中的厌氧微生物群体对C、N、P比为BOD5:N:P100:6:1；有机固体废弃物、堆肥发酵C：N=30：1，C：P=75-100：1 为了保证污（废）水生物处理和有机固体废物生物处理的效果，要按C、N、P比配给营养。,五、微生物的营养类型,按照微生物对碳源的需求,（2）按能量来源不同,光能营养型：从
21、光线中获取能量,化能营养型：从物质的氧化过程中获取能量,由此可将微生物划分为四种营养类型,光能自养型:这类微生物以光作为能源进行光合作用，以无机化合物作为供氢体，还原CO2，合成有机物，可在完全无机环境中生存，它们含有叶绿素或细菌体叶绿素，常见的如：蓝细菌、红硫细菌，绿硫细菌。,光能异样型,以光作为能源，有机物为供氢体，将CO2还原，合成有机物，如红螺菌一异丙醇味供氢体，还原CO2产生糖类。该类微生物缺乏合成生长素的能力，因此提供生长素时才能生长，可用于处理高浓度有机废水厌氧处理。,化能自养型,以CO2或碳酸盐为碳源，以氨或硝酸盐为氮源，能量来自一些无机物氧化时产生的化学能，供氢体是H2、H2
22、S、Fe2+或NO3-，CO2还原。,化能异样型,这类微生物主要依靠有机物生活，有机物既是碳源又是能源，自然界大多数有机物属于这种类型，该类微生物有腐生性、兼性寄生、专性寄生。,混合营养型,既可以用无机碳作为碳素营养，又可以以有机碳化合物作为营养物质，即为兼性自养微生物。,六、微生物的培养基（medium，复数media；或culture medium）,1、培养基,培养基是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。配制培养基时应尽快配制并立即灭菌，否则就会令杂菌丛生，并破坏其固有的成分和性质。,2、配制方法,(1)烧杯中加一定量的蒸馏水（或去离子水或自来水，视试验要求而
23、定）；(2)按配方称取各营养成分，然后将各营养成分逐一加入，待每一种成分溶解后方可加入下一成分，否则会引起沉淀物形成。各成分加入的顺序是：缓冲化合物；无机元素；微量元素；维生素及其他生长因子；(3)调整pH值，用100g/L NaOH或体积百分数10 HCl调；(4)过滤：用纱布或滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤；(5)分装：分装于试管或锥形瓶中；(6)置高压蒸气灭菌锅内灭菌，冷却备用（须先包扎）。,3、培养基的种类,(1)按培养基组成物的性质分,天然培养基,组合培养基,半合成培养基,(2)按培养基外观的物理状态分类,液体培养基,固体培养基,半固体培养基,脱水培养
24、基,(3)按培养基对微生物的功能分类,基础培养基,选择性培养基,鉴别性培养基,加富（富集）培养基,天然培养基（complex media或undefined media）,利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。,营养成分既复杂又丰富，难以说出其确切化学组成。只适用于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养基或某些发酵产物的生产等。,组合培养基(chemical defined media)，又称合成/综合(synthetic media)培养基,用多种高纯化学试剂配制成。成分精确、重复性高，但价贵、配制麻烦，微生物生长比较一般。,仅适用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌
25、种鉴定等对定量要求较高的研究工作中。,半合成培养基（semi-synthetic media），又称半组合培养基（semi-defined media）,主要以化学试剂配制，同时还加入有某种或某些天然成分。,严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何组合培养基，因其中含有一些未知的天然成分，故实质上也只能看作是一种半组合培养基。,液体培养基,一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模地培养微生物。,固体培养基（solid media）,按固态的性质，又可分为：a、固化培养基（solidified media），常称“固体培养基”，由液体培养基加入适量凝固剂（gelli
26、ng agent）而成，如加12琼脂（agar）或512明胶（gelatin），还可用海藻酸胶（alginate）、脱乙酰吉兰糖胶（gelrite）和多聚醇F127（pluronic polyol F127）。但琼脂是最优良的凝固剂。b、非可逆性固化培养基：一旦凝固后不能再重新融化的固化培养基，如血清培养基或无机硅胶（silica gel）培养基等，后者专门用于化能自养细菌的分离和纯化等方面。c、天然固态培养基：由天然固态物质直接配制成培养基，如培养真菌用的麸皮、米糠、木屑、纤维或稻草粉配制成的培养基；由马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、大豆、面包或动植物组织直接制备的培养基等。d、滤膜（mem
27、brane filter）：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。若把滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有液体培养基的纤维素衬垫上，就形成具有固化培养基性质的培养条件。滤膜主要用于对含菌量很少的水中微生物进行过滤、浓缩，然后揭下滤膜，把它放在含有适当液体培养基的衬垫上培养，待长出菌落后，就可计算单位水样中的实际含菌量。,固体培养基在科学研究和生产实践上用途很广。例如，可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选种、育种、菌种保藏、生物活性物质的生物测定、获取大量真菌孢子以及用于微生物的固体培养和大规模生产等。,半固体培养基（semi-solid media）,指在液体培养基中加入少量凝固剂而配制
28、成的半固体状态培养基，例如“稀琼脂”（sloppy agar），它们在小型容器倒置时不会流出，但在剧烈振荡后则呈破碎状态，可加0.30.5琼脂制成。,半固体培养基可放入试管中形成“直立柱”，用于细菌的动力观察，趋化性研究，厌氧菌的培养、分离和计数，以及细菌和酵母菌的菌种保藏等，若用于双层平板法中，还可测定噬菌体的效价。,脱水培养基（dehydrated culture media）,又称脱水商品培养基（dehydrated commercial media）或预制干燥培养基（pre-fabricated dried culture media），指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要
29、加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。,基础培养基,由牛肉膏、蛋白胨、NaCl按一定比例配制而成，这种培养基一般微生物均可生长。,选择性培养基（selected media）,一般根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。,鉴别性培养基（differential media）,一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色即可方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。,最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB
30、（Eosin Methylene Blue）培养基。在饮用水、牛奶的大肠菌群（coliforms）数等细菌学检查中有重要用途。,加富（富集）培养基（enriched selected media）,利用分离对象对某种营养物有一特殊“嗜好”的原理，或利用该分离对象对某种制菌物质所特有的抗性，而使对此抑制剂表现敏感的优势菌生长大受抑制，而使目的菌种大量繁殖。,七、营养物质加入细胞的方式,除原生动物外，其他各大类有细胞的微生物都是通过细胞膜的渗透和选择吸收作用而从外界吸收营养物的。不同营养物质进入细胞的方式也不同，概括有4种方式：单纯扩散、促进扩散、主动运输、基团转位。,(一)单纯扩散（simple
31、 diffusion）,单纯扩散又称被动运输（passive transport），指疏水性双分子层细胞膜（包括孔蛋白在内）在无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲水性分子被动通过的一种物质运送方式。运送的物质主要是O2、CO2、水、乙醇和某些氨基酸分子。,单纯扩散是物理过程，由高浓度区向低浓度区扩散，不与膜上的分子发生反应。这种扩散是非特异性的，扩散速度慢，不需要消耗能量，不是细胞获取营养物的主要方式。,（二）促进/成扩散（facilitated diffusion）,(1)概念：促进扩散指溶质在运送过程中，必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体蛋白（carri
32、er protein）的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式；,(3)运送过程：载体蛋白（又叫渗透酶，permease）在细胞膜外与营养物质发生可逆性结合，携带营养物质通过细胞质膜进入细胞，然后与营养物质分离，它本身再返回细胞质膜外表面与另一营养物质可逆性结合，如此不断循环。(4)依靠浓度梯度驱动，不消耗能量，渗透酶起加速运输作用。(5)多见于真核生物，如红细胞和酵母菌中糖的运输。,(2)运送对象为有些非脂溶性物质，如糖、氨基酸、金属离子等；,（三）主动运输（active transport）,(1)主动运输指一类须提供能量（包括ATP、质子动势（proton motive force，pf
33、m，指因细胞膜外表面聚集质子而引起的膜两侧电位差）或“离子泵”等）并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象的变化，而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运输方式。,(2)运送对象：主要有无机离子、有机离子和一些糖类（乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蜜二糖）等。(3)消耗能量,根据底物与离子共同运载机理：,主动运输,渗透酶,（4）主动运输的类型,单一运载是带电荷或不带电荷的物质通过载体进入细胞的运输方式。,协同运载是指两种底物通过同一载体按同一个方向运输的方式。,反向运载是两种底物通过同一载体以相反方向同时移动，阳离子及非电荷物质由胞内排出。,（5）主动运输的作用机制,钾钠泵主动运输,离子浓度梯度主动运输,H+
34、浓度梯度主动运输,（四）基团转位（group translocation）,(1)基团转位是一类既需特异性载体蛋白的参与，又需耗能的一种物质运送方式。其特点是溶质在运送前后还会发生分子结构的变化，因此不同于一般的主动运输。(2)运送对象：主要用于运送各种糖类（葡萄糖、果糖、甘露聚糖和N-乙酰葡萄糖胺等）、核苷酸、乙酸、丁酸和腺嘌呤、嘧啶等。(3)主要靠磷酸转移酶系统（phosphotransferase system）即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统进行。每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个ATP的能量。,4种运送营养物质方式的比较,43 微生物的呼吸作用和产能代谢,微生物的生长繁殖，需要
35、吸收营养合成细胞组分。合成细胞组分及维持生命活动所需的能量需要产能代谢来提供，产能代谢即能量的产生与转移都是通过呼吸作用来完成。,一、微生物的呼吸作用,1、呼吸作用,也称生物氧化作用，即在细胞内酶的作用下，将营养物质氧化同时释放能量的过程。,2、电子供体（供氢体)和电子受体（受氢体）,微生物的呼吸作用是氧化与还原的统一过程，在氧化还原反应中，凡失去电子的物质称电子供体（供氢体）-被氧化；凡接受电子的物质称电子受体（受氢体）-被还原。,二、产能代谢与呼吸作用的类型,微生物的呼吸作用伴随着能量代谢，不同种类的微生物产能方式不同，但它们有一个共性能量的转移都是通过能量的转换站ATP（三磷酸腺苷）,1
36、、ATP 的结构和作用,（一）ATP三磷酸腺苷,我们先来认识ATP。它是一种有机物，称为三磷酸腺苷英文缩写为ATP。A表示腺苷，T表示三，P表示磷酸盐。Adenosine tri-phosphate。它是一种各种活细胞中普遍存在的高能磷酸化合物。,ATP、ADP 和无机磷酸广泛存在于细胞内，起着储存和传递能量的作用。因此,也称为能量传递系统（energy-transmitting system）。ATP 的分子结构式见下图。,腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的分子结构式,2、微生物产生能量的去向,变为热量散失掉；共给反应和生命活动的其他活动需要；贮存在ATP中，需要时通过水解释放出来，每释放一个高能
37、磷酸键，释放出31.4KJ的能量；,ATP ADP+H3PO4+31.4KJADP+H3PO4 ATPAMP+2H3PO4 ATP,水解,ATP ADP+H3PO4+31.4KJADP+H3PO4 ATPAMP+2H3PO4 ATP,ATP ADP+H3PO4+31.4KJADP+H3PO4 ATPAMP+2H3PO4 ATP,以 ATP 形式贮存的自由能，用于提供以下各方面对能量的需要：提供生物合成所需的能量。在生物合成过程中，ATP 将其所携带的能量提供给大分子的结构元件，例如氨基酸，使这些元件活化，处于较高能态，为进一步装配成生物大分子蛋白质等作好准备。是为细胞各种运动（如鞭毛运动等）提
38、供能量来源。为细胞提供逆浓度梯度跨膜运输营养物所需的自由能 在 DNA、RNA、蛋白质等生物合成中，保证基因信息的正确传递，ATP 也以特殊方式起着递能作用等等 在细胞进行某些特异性生物过程如固定氮素时提供能量。,3、ATP生成的具体方式,基质（底物）水平磷酸化：厌氧或兼性厌氧微生物在基质氧化过程中产生一种高自能的中间体；氧化磷酸化：好氧微生物在呼吸过程中通过电子传递系统产生ATP的过程；光合磷酸化：光引起叶绿素、菌紫素逐出电子，通过电子传递系统产生ATP的过程。,（二）呼吸类型,按照电子受体不同，呼吸类型：发酵、好氧呼吸与无氧呼吸三种代谢途径以及底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化三种化能
39、与光能转换为生物通用能源的能量转换方式。,发酵(酵解),在无外在电子受体时，厌氧微生物氧化部分有机物，以它的中间代谢产物(分子内的低分子有机物)为最终电子受体，释放少量能量，其余的能量保留在最终产物中。以葡萄糖的酵解为例葡萄糖的逐步分解称糖酵解(即EMP途径或EM途径，Embden Meyerhof pathway)。糖酵解几乎是所有具有细胞结构的生物所共有的主要代谢途径。,EMP 途径及某些微生物以丙酮酸为底物的发酵产能,EMP 途径 以葡萄糖为起始底物，丙酮酸为其终产物，整个代谢途径历经 10 步反应，分为两个阶段；,第一阶段为耗能阶段 在这一阶段中，不仅没有能量释放，还在以下两部步反应中
40、消耗 2 分子 ATP：在葡萄糖被细胞吸收运输进入胞内的过程中，葡萄糖被磷酸化，消耗了 1 分子 ATP，形成 6-磷酸葡萄糖；6-磷酸葡萄糖进一步转化为 6-磷酸果糖后，再一次被磷酸化，形成 1,6-二磷酸果糖，此步反应又消耗了 1 分子 ATP。而后，在醛缩酶催化下，1,6-二磷酸果糖裂解形成 2 个三碳中间产物：3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮。在细胞中，磷酸二羟丙酮为不稳定的中间代谢产物，通常很快转变为 3-磷酸甘油醛而进入下步反应。因此，在第一阶段实际是消耗了 2 分子 ATP，生成 2 分子 3-磷酸甘油醛；这一阶段为第二阶段的进一步反应做准备，故一般称为准备阶段。,第二阶段为产能阶段
41、 在这第二阶段中，3-磷酸甘油醛接受无机磷酸被进一步磷酸化，此步以 NAD+（辅酶）为受氢体发生氧化还原反应，3-磷酸甘油醛转化为 1,3-二磷酸油甘酸；同时，NAD+接受氢（2e+2H+）被还原生成 NADH 2。与磷酸己糖中的有机磷酸键不同，二磷酸甘油酸中的 2 个磷酸键为高能磷酸键，在 1,3-二磷酸甘油酸转变成 3-磷酸甘油酸及随后发生的磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸的 2 个反应中，发生能量释放与转化，各生成 1 分子 ATP。,EMP 途径以 1 分子葡萄糖为起始底物，历经 10 步反应，产生 4 分子 ATP，由于在反应的第一阶段消耗 2 分子 ATP，故净得 2 分子 ATP；同
42、时生成 2 分子 NADH 2 和2分子丙酮酸。,微生物在无氧条件下的能量代谢，极为重要的是图 中的第三阶段，即丙酮酸后的发酵。没有丙酮酸后的发酵，细胞在无氧条件下难于持续获得生长与代谢需要的能量，此即发酵产能的实质内涵。但 ATP 的生成以 EMP 途径的第二阶段为主，因此，EMP 是微生物在无氧条件下发酵产能的重要途径。,丙酮酸是各种微生物进行葡萄糖酵解的产物：丙酮酸在各种微生物的发酵作用下，生成各种最终产物。各种发酵类型及其最终产物见表1.4-4,V.P反应和甲基红反应,V.P反应V.P反应混合酸发酵(又称甲酸发酵)是大多数肠杆菌的特征如大肠埃希氏茵的发酵产物有甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、
43、CO2及H2等。产气肠道杆菌也进行混合酸发酵，其丙酮酸经缩合、脱羧而变成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中易被氧化成二乙酰。二乙酰可与蛋白胨水解出的精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，这称为V.P试验(Voges Proskauer test)。产气肠道杆菌V.P试验阳性，大肠埃希氏菌的VP试验阴性。所以，V.P试验常用于区别产气肠道杆菌和大肠埃希氏菌。,甲基红反应 产气肠道杆菌进行混合酸发酵产生中性的乙酰甲基甲醇；而大肠埃希氏菌的混合酸发酵产生酸，使培养液PH下降至4.2或更低，比产气肠道杆菌培养液的PH低。在两者的培养液中加入甲基红，则大肠埃希氏菌的培养液呈红色，甲基红反应阳性；产气肠道杆菌的培
44、养液呈橙黄色，为甲基红反应阴性。,V.P试验和甲基红试验是卫生防疫常用的鉴定方法。,有氧呼吸,在物质与能量代谢中底物降解释放出的高位能电子，通过呼吸链（也称电子传递链）最终传递给外源电子受体 O 2 或氧化型化合物，从而生成 H 2 O 或还原型产物并释放能量的过程，称为呼吸或呼吸作用（respiration）。在呼吸过程中通过氧化磷酸化合成 ATP。呼吸与氧化磷酸化是微生物特别是好氧性微生物产能代谢中形成 ATP 的主要途径。在呼吸作用中，NAD、NADP、FAD 和 FMN 等电子载体是呼吸链电子传递的参与者。因此，它们在呼吸产能代谢中发挥着更为重要的作用。,呼吸又可根据在呼吸链末端接受电
45、子的是氧还是氧以外的氧化型物质，将它分为有氧呼吸与无氧呼吸两种类型。以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸(aerobic respiration)，而以氧以外的外源氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸(anoxic respiration)。,以葡萄糖为例在好氧呼吸过程中，葡萄糖的氧化分解分两阶段：葡萄糖经EMP途径酵解。这一过程不需要消耗氧，形成中间产物丙酮酸。丙酮酸的有氧分解。在环境有氧的条件下，细胞行有氧呼吸，丙酮酸先转变为乙酰 CoA（acetyl-coenzymeA，acetyl-CoA），随即进入三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，简称 TCA 循
46、环)，被彻底氧化生成 CO 2 和水，同时释放大量能量，见 TCA 循环图。,三羧酸循环（TCA）,电子传递链及ATP的生成,由此可以看出，1分子NADH2可生产3个ATP，而1分子FADH2 可生产2个ATP。,从 TCA 循环图与电子传递链产能反应可见，1 分子丙酮酸经 TCA 循环而被彻底氧化，共释放出 3 分子 CO 2，生成 4 分子的 NADH 2 和 1 分子的 FADH 2，通过底物水平磷酸化产生 1 分子的 GTP。而每分子 NADH 2 经电子传递链，通过氧化磷酸化产生 3 分子 ATP，每分子 FADH 2 经电子传递链通过氧化磷酸化产生 2 分子 ATP，因此，1 分子
47、的丙酮酸经有氧呼吸彻底氧化，生成 ATP 分子的数量为：4 3+1 2+1=15。,微生物行有氧呼吸时，葡萄糖的利用首先经 EMP 途径生成 2 分子丙酮酸，并经底物水平磷酸化产生 4 分子 ATP 和 2 分子 NADH 2。在有氧条件下，EMP 途径中生成 2 分子 NADH 2 可进入电子传递链，经氧化磷酸化产生 6 分子 ATP。因此，在有氧条件下，微生物经 EMP 途径与 TCA 循环，通过底物水平磷酸化与氧化磷酸化，彻底氧化分解 1mol 葡萄糖，共产生 40mol ATP。但在 EMP 途径中，葡萄糖经 2 次磷酸化生成 1,6-二磷酸果糖的过程中有 2 步为耗能反应，共消耗了
48、2 分子 ATP，故净得 38mol ATP。,已知 ATP 水解为 ADP 释放的能量约为 31.8kJ mol，故 1mol 葡萄糖被彻底氧化约有 1 208kJ（31.8kJ 38）的能量被转储于 ATP 的高能磷酸键中。1mol 葡萄糖被彻底氧化为 CO 2 和 H 2 O 可释放的总能量约为 2 822kJ。因此好氧微生物通过有氧呼吸利用葡萄糖，其能量利用效率约为 43，其余的能量以热等形式散失。可见，生物机体在有氧条件下的能量利用效率极高。,外源呼吸与内源呼吸,外源呼吸：微生物利用外界共给的能源进行呼吸,内源呼吸：外界没有供给能源，而是利用自身内部贮存的能源物质(如多糖、脂肪、聚P
49、经基丁酸等)进行呼吸。内源性呼吸的速度取决于细胞的原有营养水平：有丰富营养的细胞具有相当多的能源贮备和高度的内源呼吸；饥饿细胞的内源呼吸速度很低。不过，这两种细胞在有外源性能源供给时，可能进行同等程度的呼吸反应。,无氧呼吸,无氧呼吸亦称厌氧呼吸。某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下能进行无氧呼吸。在无氧呼吸中，作为最终电子受体的物质不是分子氧，而是 NO 3-、NO 2-、SO 4 2-、S 2 O 3 2-、CO 2 等这类外源含氧无机化合物。与发酵不同，无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有氧化磷酸化作用而生成 ATP，也能产生较多的能量。但由于部分能量在没有充分
50、释放之前就随电子传递给了最终电子受体，故产生的能量比有氧呼吸少。,在无氧呼吸中，作为能源物质的呼吸基质一般是有机物，如葡萄糖、乙酸等，通过无氧呼吸也可被彻底氧化成 CO 2，并伴随有 ATP 的生成。例如：,（1）硝酸盐还原细菌在厌氧条件下，可把 NO 3-作为电子的最终受体，即:,兼性厌氧的脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）在无氧条件下行无氧呼吸，以氢为电子供体，硝酸盐为最终电子受体，还原硝酸盐，进行彻底地反硝化作用：,（2）在厌氧条件下，硫酸盐还原细菌可以 SO 42-作为最终电子受体，即：,脱硫弧菌属（Desulfavibrio）等少数几种菌能以有机物（乳酸、
