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1、课题1 微生物的实验室培养,专题2:微生物的培养与应用,微生物包括哪五类：,病毒细菌放线菌真菌原生动物,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,微生物基础知识,细菌的外形与大小,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,细菌的构造,图1-3
2、 细菌的结构,*细胞壁,结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞；,使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要
3、依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,放线菌,1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,病毒的结构,病毒,SARS病毒、禽流感病毒,朊病毒（蛋白质病毒）,2、病毒的增殖：,真菌,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,生殖,直立菌丝 营养菌丝,腐生生活,孢子生殖,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌（autotroph）异养菌（heterotroph）腐生菌寄生菌 大部分病原菌,1.何为培养基？,3.不同的培
4、养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养元素？有何作用？请举例说明。,阅读教材P1415相关内容，回答以下问题：,2.按照不同的培养基划分标准，培养基有哪些种类、配制特点及其应用？,（一）培养基,一、基础知识：,（一）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容
5、),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落，菌苔,半固体培养基,无动力 有动力(弥散),(是否运动？),4.培养基的用途,液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种,1.何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？,2.什么是消毒？灭菌？两者有何区别？,3.常用的消毒与灭菌的方法有哪些？有何要求？,4.请说出干热灭菌
6、法和高压蒸汽灭菌法的操作步骤。,（二）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,（）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三种方式。,2.消毒与灭菌的概念及两者
7、的区别,（2）灭菌的定义：,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,煮沸消毒法:100煮沸5-6min 巴氏消毒法：7075 下煮30min或 80 下煮15min 化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;用氯气消毒水源等 紫外线消毒,(1)消毒的方法,3.常用的消毒与灭菌的方法,灼烧灭菌干热灭菌：160170 下加热12h。高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持1530min.,(2)灭菌的方法,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的
8、休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,无菌技术,1关于微生物营养物质的叙述中，正确的是A、是碳源的物质不可能同时是氮源 B、凡碳源都提供能量C、除水以外的无机物只提供无机盐 D、无机氮源也能提供能量,答案：D,课堂练习,2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A、防止杂菌污染 B、消灭杂菌C、培养基和
9、发酵设备都必须灭菌 D、灭菌必须在接种前,答案：B,3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入。,自养型微生物,含碳有机物,（3）若除去成分，加（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
10、,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,3.微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,四、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌),1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
11、分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,8灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。,倒平板技术,1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。,1,2,3,4,倒平板技术,2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。,1,2,3,4,倒平板技术,1,2,3,4,3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约1020mL)倒入培
12、养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。,倒平板技术,1,2,3,4,4.等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,9倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,问题讨论,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼
13、烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,微生物的接种技术：,平板划线的操作方法,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划
14、破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到
15、菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。,2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充
16、分混匀。,3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存,1.临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2.长期保存：甘油冷
17、冻管藏法,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,本课题知识小结:,
