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1、养殖饲料氨基酸有效性测定方法已有多种可测定饲料中氨基酸利用率的方法,通常不采用单一的方法来进行测定。为方便起见将这些方法分为三大类:体外法、间接体内法和直接体内法.(-)体外法此方法的目的是通过对饲料的实验检测来估计动物可利用氨基酸的含量。体外法有3种形式：化学法、酶法和微生物法。L化学分析法这种方法多用于测定赖氨酸的利用率。前提条件是赖氨酸的胺基必须是游离状态，以确保赖氨酸的生物利用率。最原始的方法是用赖氨酸与1-氟，2,4-二硝基苯(bfluoro-2,4-dinitrobenzene,FDNB)反应，这种方法后来得到了改进。也有使用不同试剂的其它方法，如2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,
2、-trInitrobenzxenesulfonicacid,TNBS),还有基于染料(如酸性桔12,acidorange12)被蛋白质吸收的简易方法。虽然同一种饲料的许多样品的化学检测方法可能有异，而且可能在质量控制上起作用。然而，并不鼓励直接用动物检测氨基酸利用率与化学方法检测之间的结果比较。Batterham等用化学方法和猪的生长实验对同一饲料的赖氨酸利用率的估计做了一系列的实验,这些实验表明化学估计和用猪做实验得到的数据没有相关性。对谷类饲料中赖氨酸利用率进行的类似比较，也发现化学和生物学估计的结果之间没有相关。用FDNB和TNBS法及鸡生长鉴定法测定了几种鱼粉、肉骨粉、羽毛粉和动物毛粉
3、(hairmeal)中赖氨酸的利用率。鸡生长法结果与FDNB-赖氨酸和TNBS-赖氨酸之间的相关系数分别为0.83和0.90。2 .酹法有人建议用模拟肠道内防消化的体外测试法。有几种能(包括胃蛋白酷、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)曾被实验过。一致认为该法最大的弊端是很难确定一种酎或酎复合物真正模拟了体内混合酹的反应,而且这些醐是否对各种饲料都有效也很难确定。体外酶消化的终产物包括氨基酸、不同长度的肽和未被消化的蛋白。3 .微生物评定法曾经是饲料中氨基酸含量测定的基本方法，也被用来估测氨基酸利用率。这种方法是基于微生物的生长对所研究的氨基酸有特别需求，用作实验的微生物是细菌(Streptoc
4、occuszymogenes)和原生动物(Tetrahynlenapyriformis)o由于微生物法测定氨基酸利用率存在许多理论和实际中的困难，至今很少用它。通常体外测定法为加工工艺对氨基酸利用率的影响提供有用的资料,特别是加热过程对赖氨酸的破坏。但是，用体外法测得的数据来作为饲粮配方的依据并没有得到认可。关于体外法的更详细的资料可参考CarPenter(1973)和Sibbald(1987)的综述(二)间接体内法用实验动物测定氨基酸生物利用率很显然比单独在实验室里进行更理想，但是，用动物来直接测定既费时、成本也高，因此设法用间接法来测定氨基酸利用率。有两种这样的方法,一种是用血浆氨基酸浓度
5、来测量,另一种是通过测量氮的消化率来测定。自从RiChardSon等(1953)和DentorS和Elvehjem(1954)所做的实验以来，就已清楚地知道动物血液中的氨基酸浓度受饲粮水平的影响，而且用血浆中限制性氨基酸的浓度来估计家禽和猪的氨基酸需要已完全得到了应用。有人曾提议用血浆中氨基酸浓度的改变来估计饲料中氨基酸的利用率，不过这种方法没有得到更全面的改进，主要是由于有多种因素在制约着血浆中氨基酸浓度。而且，进行血浆氨基酸浓度分析有许多困难，还有经费问题。如果单个氨基酸的消化率和总的蛋白质消化率之间有密切的相关,那么通过氮的消化率的测量对氨基酸利用率进行预测，为间接体内法提供了方便的途径
6、。在一些实验中，曾报道过某些氨基酸的利用率与氮消化率之间存在一定的相关，但这种方法仍有局限性。（三）直接体内法1 .氨基酸消化率许多研究者着力于利用饲料中可消化氨基酸水平来配制饲粮。肠道后段的微生物发酵改变了流入粪中的氨基酸，从而导致氨基酸在肠道的损失（或合成）。这样并不利于动物体内的氨基酸营养作用。因此，通过比较饲粮摄入和粪中排泄来测定消化率不能很可靠地估计饲料中对动物有用的那部分氨基酸。微生物降解说明了有大量的氨基酸从后段损失掉，与粪中消化率相比，回盲段消化率更具营养意义。在大部分实验中，回盲消化率值比粪消化率值低，这说明粪消化率过高地估计了饲料来源的粪中氨基酸值。以饲料摄入和粪尿中排出直
7、接比较测定的消化率受粪尿中内源物质的影响。由于那些具有蛋白质特性的消化酶和脱落到消化道的粘膜上皮细胞，因此，包括氨基酸在内的内源性含氮物质大量存在。为尽可能减少这些内源性排泄物对消化率测定数据的影响，将粪中这部分内源氮扣除掉，所得的消化率叫真消化率。估测内源氨基酸的方法之一就是在动物饲喂无氮饲粮时测定其粪中的氨基酸的损失,但是内源损失受饲粮摄入量和种类的影响。例如，CraigandBroderick（1981）在鼠中发现每消耗Ikg干物资，相应的内源氮损失为1.84g0另一种方法就是找出粪氮（氨基酸）损失与蛋白质（或氨基酸）摄入之间的回归关系，这2种方法都不能解析饲粮摄入的蛋白质对分泌到消化道
8、的内源蛋白的影响作用。饲料中的每种氨基酸都有4种可能的值来表示其消化率：即粪和回盲的表观和真消化率。（1）猪回肠氨基酸消化率的测定由于大肠微生物干扰较大，使测定值偏高（约10%）,故均采用回肠末端收取食糜的方法测定回肠氨基酸消化率。由于从消化道后段排出的氨基酸对机体没有价值（Rerat,1978）,故必须测定来自回肠的氨基酸。这就需要在氨基酸流入结肠时，用外科矮管来收集所有的消化液或是消化液样品。采用这种方法要在回肠后段安装一个瘦管，另一个瘦管安在回肠末端收集已测量好的回流的消化液样品。使用的瘦管有凹型和T型2种，凹型痿管能准确测定消化液的流出量，但是，胃肠道的破坏会影响到小肠的功能。使用T型
9、疹管时，在食糜离开回肠时收集消化液样品，根本不会损坏肠道，然而，T型痿管需要一个标记来测定流出量。安装屡管的动物限制在笼子里，一天24h进行收集，从30min到12Omin不等收集到的消化液样品测出总的排泄量。取完样品后，剩余的从末端瘦管流回猪体内，比较回肠氨基酸流出量和饲粮氨基酸摄入量可计算出表观回肠消化率。这种方法是可行的和有用的，因为它显示出了动物最小的氨基酸净损失量。表观消化率经过内源损失修正后，得到的真消化率结果更准确，改进程度视日粮摄入的氨基酸量而定。但是BUraCZeUSki和HOraCZynSki(1983)发现，把蛋白质水平从10%提高到20%对表观回肠消化率无影响。实际上大
10、多数研究已把表观回肠消化率作为饲料氨基酸利用率的指标。Taverner等(1981)测定了谷物中的氨基酸回肠表观和真消化率。就赖氨酸而言，3种小麦样品的表观值从70%到81%,真消化率值从79%到89乐因此用内源氨基酸进行修正很少改变它变化的域值。通过外科手术收集回肠末端食糜的主要方法有：T型管(simpleT-CannUlas)、桥式屡管(Re-entrantCannUl.as)、回一直肠接合技术(Ileo-rectalanastomosistechnique)、可移动(可操纵)的回盲痿手术(Steeredileo-Caecalvalve)O每种方法的测值并无太大的差异，加上氨基酸分析测定的
11、误差本身较大，所以很难说哪一个方法测值最准确。目前主要是看哪种方法最简便，包括取样程序和对术荷猪的影响。相对说来，回一直肠吻合术还较可取，虽手术麻烦，但粪样(食糜)收集简单，而且可做到样品有代表性。(2)禽类氨基酸消化率的测定禽饲料氨基酸消化率的测定相对较简单，因禽大肠较短，而且主要是盲肠，所以不必安装屡管，安装也困难。为减少盲肠的影响，可切除盲肠。关于切不切除盲肠现有争议，大多数饲料切除盲肠与否对氨基酸消化率无显著影响，只少数饲料，如肉骨粉等切除盲肠氨基酸消化率降低。另一些人认为盲肠在氮代谢中对尿中尿酸的二次利用有重要作用；未经小肠吸收的氨基酸和短肽也可为盲肠微生物充分利用，因此不宜切除。氨
12、基酸分析仪的测定值误差较大，必然会影响到饲料氨基酸的消化率测值的准确性，一次试验测得的值很难说准确、可靠，一般取平均值较合理。2 .氨基酸真消化率测定前面所述方法测定的饲料氨基酸消化率都是指表观消化率。收集的回肠末端食糜或粪样中的氨基酸实际上包括了2个部分，即饲料中未被消化吸收的残余和整个消化道的分泌物、细胞脱落物等内源性的氨基酸等。因此，为了准确测定饲料氨基酸的真消化率，就必须正确评估动物的内源性氨基酸排泄量。评价方法主要有：(1)无氮日粮法和回归外推法测定饲料氨基酸真消化率的最为经典的方法是MitCheII(1924)建立的无蛋白质(氮)日粮法(Protein-freediet)。其假定条
13、件是动物采食不含任何蛋白质的饲粮后，进入食糜或粪中的蛋白质、氨基酸即为内源性的，并且在不同饲粮条件下动物内源性氨基酸的排泄量和氨基酸组成是相同或相似的。然而事实上并非如此，随着动物采食蛋白质量的增加，其内源性氨基酸的排泄亦相应增加。Low(1979)指出，动物在采食无氮饲粮后，改变了动物的代谢而影响内源性氨基酸的排泄量。Ozimek等(1985)发现动物采食无氮饲粮后，胰腺分泌的消化酶减少，分泌的蛋白质量亦减少。由于无氮饲粮影响动物消化道的分泌和吸收功能，一般认为无氮饲粮法低估了猪的内源性氨基酸排泄量，即高估了饲料的氨基酸真消化率。为了克服无氮日粮法的上述缺陷，Carlson等(1970)发明
14、了一种回归外推法，用以估测内源性氨基酸排泄量。其方法要点是给猪饲喂不同蛋白质水平的饲粮，分别测定粪或食糜中的氨基酸量，然后用数理统计的方法，推算出饲粮蛋白质水平为零时粪或食糜中的氨基酸即为内源性氨基酸。该方法虽然考虑了饲粮蛋白质含量对内源性氨基酸排泄的影响，但与无氮饲粮法一样，在计算饲料氨基酸真消化率时，仍然存在不同的饲料都扣除同样量内源性氨基酸的问题。另外，SOUffrant(1991)经过研究发现，蛋白质采食量与内源性氨基酸排泄之间并不存在线性关系，因此，本方法也难以对内源性氨基酸排泄作准确估测。(2)酶解酪蛋白/超滤法MoUghan等(1990)针对上述问题，提出了一种酶解酪蛋白/超滤的
15、新方法来估测动物的内源性氨基酸排泄。其技术原理和过程如下：给动物饲喂含酶解酪蛋白(分子量低于8.25Xl()3g)的半纯合饲粮，然后收集回肠末端食糜，立即通过离心和超滤等方法,将食糜中的大分子蛋白质(分子量大于L65Xl(fg)与小分子蛋白质(分子量小于L65X1(2)迅速分离开来，大分子量蛋白质即为内源性的，而小分子量蛋白质是饲粮中未被吸收的部分。当然内源性蛋白质也有可能被水解为小分子蛋白质，但所占比例很小，可以忽略不计。BUttS等(1991)将该方法应用于生长大鼠的内源性氨基酸排泄的测定，其测定值高于无氮日粮法，而与ISN同位素标记法的结果相当。说明该方法在评估动物内源性氨基酸排泄上有相
16、当的准确性。Yin和MCCraCken(1996)认为，尽管此方法还未见有直接测定猪内源性氨基酸排泄的报道，但仍不失一种较为有应用价值的试验方法。(3)15N同位素标记法目前认为15N同位素标记技术是直接测定内源性氨基酸排泄最有效方法，而且可用于测定饲粮成分变化对内源性氨基酸排泄的影响。W同位素标记技术方法可通过2种途径进行，一是对饲料蛋白质进行标记；二是对动物的氨基酸库即内源性氨基酸进行标记。15N同位素标记的饲料非常昂贵而且不易得到，因而限制了该技术的广泛应用。这样，大多利用各种不同的15N同位素标记动物的氨基酸库，即使用15N同位素进行连续的静脉灌注(或称稀释)，粪中或食糜中内源性氨基酸
17、可以通过同位素的稀释方法来计算。在应用取同位素稀释技术时，有3个必须解决的现实问题：一是被标记的含氮物的选择；二是BN丰度稳态的判断；三是前体库的选择。最好选择取同位素标记的各种氨基酸的混合物作为标记。但由于价格昂贵，实际应用中仍然只选择一种氨基酸进行标记。作为标记物的氨基酸要具有以下的特点：可以发生转氨基作用，使标记的同位素转移到其它氨基酸中去；被标记处理后不影响采食量；被标记后不影响氨基酸代谢，不会导致氨基酸的不平衡。Grala等(1998)经过研究发现，唯有亮氨酸完全符合上述条件。因此,N标记亮氨酸被普遍选作测定内源性氨基酸的标记物。其灌注剂量一般为4.040.Omg/kg.d,灌注时间
18、89d以上。在运用,5N同位素稀释技术时，采样时15N的丰度应当达到一个稳定状态。回肠末端食糜中内源性氨基酸中15N的丰度与血清三氯乙酸(TCA)可溶部分中的力丰度是相似的。但是血清总氮TCA可溶部分中”N丰度存在昼夜变化。而SChUlZe(1994)指出，W灌注58d后，并在2次饲喂的中间采血，iN丰度的稳定状态基本可以达到。内源性氨基酸的前体库包括所有代谢组织，而且主要是全身肌肉组织。因此必须选择一个与15N的亲和力相似的参照物，来代替前体组织的15N丰度。而这种参照物中15N丰度也可代表回肠末端食糜中内源性氨基酸的以丰度。血清往往是最理想的参照物。(4)高精氨酸法如前所述，纵同位素标记技
19、术是对内源性氮前体库进行标记的，以此为基础区分回肠食糜中内源性氮与饲料中氮。Souffrant(1991)Schultz等(1991)和Nyachoti等(1997)提出了用高精氨酸标记饲粮蛋白质中赖氨酸的方法，测定内源性氮的排泄。其工作原理是：在一定条件下将饲料蛋白质中的赖氨酸与甲基异胭(melhylisourea)反应，生成高精氨酸，当高精氨酸被吸收后，在肝脏精氨酸酶的作用下，又可很快转变为赖氨酸，同时释放出尿素。高精氨酸不构成内源性氮，所以消化道脱离细胞以及分泌的消化液中不含高精氨酸，回肠食糜中高精氨酸即为饲料中未被消化吸收的外源蛋白质。动物对脏基化饲粮蛋白质和天然蛋白质具有相同的蛋白酶
20、分解和吸收能力。SoUffrarlt(1991)的研究表明，猪对高精氨酸标记过的酪蛋白和大豆分离蛋白的回肠吸收率高达97%,且只有微量(小于0.2%)的高精氨酸由血液进入肠腔。SChUIZe等(1994)指出，高精氨酸法必须使经呱基化的高精氨酸在待测饲料蛋白质中均匀分布，才能有代表性，否则影响测定结果。如果饲料蛋白质中的赖氨酸侧链被封闭，特别是经美拉德反应(Mainardreaction)后封闭时，赖氨酸侧链就不能与甲基异服反应而转化成高精氨酸。这样受热损害的饲料蛋白质经胭基化后代表性差，从而导致对内源性氮估测误差。3、氨基酸消化率体外测定技术如前所述，饲料的蛋白质和氨基酸消化率是评价单胃动物
21、饲料营养价值最为重要的指标之一。人们已普遍接受了采用氨基酸回肠末端表观或真消化率来评价猪饲料的营养价值和衡量动物的营养需要。然而测定这些指标，很大程度上要依赖荷术的试验动物，这样测定的结果虽然直观、可靠，但是十分繁琐并耗资旷时。因此，寻求一种体外试验方法来估测蛋白质和氨基酸消化率，以此评价饲料的营养价值就显得十分必要。体外消化试验一般是尽可能地模拟动物消化道环境条件来进行。但是，消化道中的酶是一个复杂多变的多防系统，因此一般情况下酷的活力受各种因素的影响较大。如喂给低蛋白高能量饲粮猪的小肠液中胰蛋白酶及胰糜蛋白酶活力分别为77.227.1和5.11.9酶活单位mL,而喂给高蛋白低能量的却分别为
22、59.420.2和6.51.9酶活单位/此。因此，不同的体外试验方法都是在相应的严格控制条件下对体内消化代谢过程进行模拟而获得的。(1)两阶段水解法丹麦BOiSen等(1994)和法国JagUelin等(1994)提出了先用PH值2.0的胃蛋白酶处理，再用胰蛋白酶处理，结束后用5ml20%的磺基水杨酸沉淀未被消化的蛋白质，经过滤后，由样品和未消化残渣含量计算出粗蛋白和氨基酸的体外消化率。虽然测得的结果变异系数(CV=3.8)很低，但体外法和体内法测得的结果相关性不强行2二0.57)。这一方法尽管可以克服采用小肠液酶活不稳定的缺陷，但反应过程仍然是在封闭容器中进行的。(2)活动尼龙袋法Sauer
23、等(1989)发明了一种用半离体的活动尼龙袋法测定了一些饲料的能量和粗蛋白消化率的方法。其过程是：被测样品Ig左右置于120目的小尼龙袋中，经过酸性胃蛋白酶处理4h后从十二指肠屡管进入试验猪的消化道，然后从粪中收集尼龙袋，这样小肠液中消化酶进入尼龙袋而被消化的氨基酸游离出尼龙袋，并且消化环境完全与体内条件一致，因此测定结果可以与粪分析法结果建立比较好的回归关系。Yin等（1995）改进为试验动物在安装十二指肠痿管的同时进行回直肠吻合,这样测定结果可与回肠末端消化率建立更好的回归关系。但是这种半离体方法仍然需要荷术动物，并非真正的离体测试方法。另外该方法因为尼龙袋在动物消化道内的滞留时间差异较大
24、，且难以调控，往往导致实验的重复性较差。（3）体外透析管法黄瑞林等（1999）指出，在体外试验的条件选择上不应该刻意追求与体内环境的一致性，而应更注重提高体外试验法的精确度和可重复性。根据仿生学原理，在实验室条件下,样品先经过胃蛋白酶水解,经中和后转移至透析管装置内，用胰蛋白酶水解，透析管的透析液可使水解产物及时透析至管外,最后定量测定透析液粗蛋白和氨基酸的含量,即可计算样品粗蛋白质和氨基酸的消失率。其适宜条件是:温度为35C,lg（精确至0.0001g）样品，胃蛋白酶浓度为0.001gmL,pH值为2.0,水解4h；经中和后，转移至透析管内，用PH值7.6且浓度为0.0025g/mL的胰蛋白酶水解24h,透析管外以300mL透析液使水解产物及时透析至管外。黄瑞林等（2000）进一步研究表明，可以用透析管体外法的测定结果来较准确地预测饲料蛋白质和大部分氨基酸的回肠末端消化率。透析管体外法的优点在于：每一测定结果的变异较小，变异系数大都在1%3%之间，符合一般分析要求。并且在可操作性、重复性和精确度方面优于其它体外方法，与回肠末端消化率结果之间的相关性很好，因此其回归模型可靠。
