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1、分子诊断及其临床应用,分子诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接从DNA/RNA水平检测基因结构及其表达水平是否正常，分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断。优点 早期诊断 特异性强 灵敏度高 适用性强,分子诊断技术平台及其应用,PCR分子诊断技术 实时荧光PCR 测序，片段分析杂交，芯片 MLPA 熔点曲线,临床常用的分子诊断技术：PCR扩增（临床最常用）探针杂交技术测序技术片段分析技术等,分子诊断技术：实时荧光定量PCR技术PCR-探针杂交技术PCR-测序技术 PCR-SSCP（单链构象多态性）PCR-RFLP（限制性片段多态性）PCR-DGGE（变性梯度凝胶
2、电泳）,科研为主,临床科研常用,Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应基因体外扩增技术,PCR 技术,高灵敏度！,链式反应分子爆炸,实时荧光（定量）PCR,定义：在PCR反应体系中，加入示踪产物的荧光分子（荧光标记的寡核苷酸探针或荧光染料），利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量的方法。,普通PCR,荧光定量PCR,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行半定量及定性分析,定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析,实时荧光（定量）PCR荧光示踪方法,荧光染料法：SYBR Green 1，EB荧光探针法：基于F
3、RET(荧光共振能量转移)技术 Taqman(水解探针)Hybridization probe(杂交探针)Molecular Beacon(分子信标),SYBR Green l 检测模式,18,是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。结合于双链核酸的小沟处，与双链DNA结合后受激产生荧光在变性条件下双链分开，荧光消失,通常在PCR的延伸阶段检测荧光缺点：没有特异性，只要是双链就会结合发光，因此对非特异性扩增和引物二聚体也会产生荧光。优点：通用性好，价格低；产物可作熔点曲线分析。,发生条件：1.供、受体分子空间位置上相互临近.2.受体分子的激发光谱必须与供体分子的发射光 谱相互重叠,荧光共振能量
4、传递：FRET(flouresence resonance energy transfer),在一定距离内淬灭基团可以吸收荧光基团发出的荧光并以更长的波长或热量的形式发射出去，这一过程称为荧光共振能量传递（FRET）,目标特异性探针在PCR的延伸阶段检测荧光,Taqman 探针（水解探针）,5端标记荧光基团，3端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5-3外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。,RQ-PCRTaqMan探针应用：定性及定量各
5、种病原微生物的分子鉴定：HBV、HCV、HIV、NG、CT、UU、HCMV、EB、TB、HPV、BKV、HSV血液病相关融合基因检测：BCR-ABL、PML-RARa、AML-ETO相关基因表达定量：G6PDH、ERCC1、P53、HER2 其他：SRY基因检测,杂交探针（Hybridization Probes）模式,Fluorescein,LC Red,22,由两条相邻的寡核苷酸探针组成，一条探针的3标记荧光基团（供者），另一探针的5标记另一荧光基团（受者）。当退火复性时，探针结合在模板上，供受基团相邻，外光源激发供体基团时，通过FRET使受体基团发出荧光，可供检测。当延伸时，两探针被置换
6、，游离出来，失去FRET结构，无可检测荧光。在PCR的复性阶段检测荧光,分子信标 molecular beacon）,分子信标是一种茎环结构的双标记寡核苷酸探针。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。在此结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。此时，荧光基团与淬灭基团形成FRET结构，致荧光淬灭。在变性后退火复性过程中，分子信标与靶DNA结合，茎环结构打开成链状，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。,分子信标探针,在变性后退火复性过程中，
7、分子信标与靶DNA结合，茎环结构打开成链状，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。,艾德公司特异引物双环探针技术,EGFR、K-ras等突变,QIAGEN公司DxS 蝎子探针技术,优点：突变含量低至1%亦可检出。EGFR突变检测、K-ras突变检测,molecular beacon探针：特异性好，背景信号低，扩增效率高，不能做溶解曲线分析，适合定性、定量及基因突变分析。,实时荧光定量PCR中的三个概念,增长曲线(primary curve)荧光阈值（threshold)CT 值(Cycle Threshold),增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系,Cycle,Fluorescence,起始模
8、板浓度的对数与C(t)值成线性反比关系 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。,荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR的方法,定量PCR方法可分为外标法和内标法定量类型可分为绝对定量和相对定量,绝对定量通过外标准品定量,绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物,初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少 在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列已知标准（通常为质粒DNA），根据扩增
9、曲线的Ct值与该扩增反应模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，则可推导出同时扩增的待测样本中初始模板量。,RQ-PCR中的绝对定量：确定样本中靶DNA的绝对含量,外标法：使用外部标准曲线的方法（绝对定量）,在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列已知标准（通常为质粒DNA），根据扩增曲线的Ct值与该扩增反应模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，则可推导出同时扩增的待测样本中初始模板量。,定量PCR的数学原理,斜率与扩增效率,使用外标定量的要求,以外标准进行定量，必须在扩增的指数期进行；Threshold 尽量处在刚刚进入指数扩增期阶段扩增指数期取决于PCR模板的相对量,使用外标的定量PCR方法的优缺点
10、,优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；缺点：PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。,定量测定的结果报告,定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多
11、少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。,相对定量通过内标定量,内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,RQ-PCR中的相对定量即测定同一样本中两种不同基因量的比率或不同样本中同一基因量的比值主要用于基因表达检测，疗效观察等例：CML病人的BCR-ABL融合基因检测 使用管家基因G6PDH或ABL,例1：目的基因Acopies/ml 管家基因B copies/mlA/B%或治
12、疗前A基因 copies/ml治疗后A基因 copies/ml 治疗后/治疗前%,相对定量结果的报告,一、分子诊断在感染性疾病中的应用,在病原微生物方面的应用,快速鉴定实时荧光PCR方法淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、结核杆菌、高危型HPV病毒、HSV病毒等定量分析实时荧光PCR方法HBV、HCV、HIV、BK、EB、HCMV等病毒分型PCR-测序法HBV病毒分型、HCV病毒分型耐药分析HBV病毒四种耐药分析 PCR-测序法结核杆菌耐药基因突变分析探针杂交技术,RT-PCR进行HBV DNA载量分析的实验流程,DNA提取,RT-PCR,血清分离,人工上样,检测报告,患者1,男，22岁，慢性乙肝
13、患者，于2010年11月起定期在我院进行HBV血清学及DNA含量检测，相关实验室数据如下:乙肝两对半结果：,高精度HBV DNA含量检测结果：,患者2，男，29岁。慢性HBV感染者。2009年8月，初次进入华西医院感染科就诊，查HBV DNA载量为1.2 E+07cp/ml，两对半检测为135阳性；HBV基因型检测为B型，未耐药；后经过拉米夫定抗病毒治疗3月，复查HBV DNA 载量为2.3 E+04cp/ml；后继续服用拉米夫定，半年后，查HBV DNA 载量为5.8 E+02cp/ml；后继续抗病毒治疗，3月后，继续复查高精度HBV，结果为70cp/ml。说明抗病毒治疗效果显著。医生建议其
14、继续服用拉米夫定，半年后继续复查HBV DNA 载量。2011年5月，听取医生建议继续复查HBV DNA 载量。检测结果为5.8 E+03CP/ml，说明HBV 继续活跃复制，可能由于基因耐药所致。,哈拉尔德楚尔豪森-2008年诺贝尔获得者,持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。,细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫
15、颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。,二、分子诊断在肿瘤中的应用,在肿瘤及血液病方面的应用,诊断JAK2V617F突变检测实时荧光PCR方法白血病融合基因筛选（BCR-ABL、PML-RARa等）IgH及TCR基因重排分析PCR+毛细管电泳个体化治疗高敏法EGFR基因29种突变分析实时荧光PCR方法高敏法Kras基因7种突变分析 AML相关预后基因突变分析PCR-测序法,Case,患者,女，54岁，某公司职员，以“咳嗽，痰中带血2月余”就诊，查影像学显示“右肺中央型肺癌伴阻塞性炎症”，纤支镜检查示“右肺中央型肺癌”，病理确诊“非小细胞肺癌，腺癌”。行TKI(络氨酸激酶抑制剂）治疗半年后临
16、床医师认为疗效不理想，经淋巴结穿刺进行EGFR基因突变检测，示EGFR的T790M突变，提示为耐药个体。建议临床停止使用TKI治疗。,分子诊断在白血病领域中临床应用,1、明确临床诊断；2、对疗效进行预判并确定治疗方案；3、动态监测白血病的微小残留病灶（MRD）；4、监测是否对靶向药物耐药；,白血病领域中常用的分子诊断技术,1、实时荧光定量PCR技术帮助诊断MRD监测2、FISH技术确诊手段3、测序技术突变监测,诊断相关融合基因：BCR-ABL、CBFB-MYH11、AML1-ETO、DEK-CAN、MLL-AF9、PML-RARA预后相关基因突变：FLT3、C-Kit、DNMT3A、IKROS
17、、NOTCH、NPM1、CEBPA,BCR-ABL融合基因：见于95以上的CML，1530%的成人ALL和25%的儿童ALL中。PML-RARA融合基因：见于90以上的APL（急性早幼粒细胞白血病）中，是APL的一个特异标志。AML1-ETO融合基因：8%的AML（急性髓细胞白血病）中可以检测到AML1-ETO融合基因。,一些较常见的白血病融合基因,E2A-PBX1融合基因：存在于3-5%的儿童，3%的成人前B细胞急性白血病（precursor B-ALL）SIL-TAL1融合基因：存在于5%-25%的T-ALL（T细胞急性白血病）病人中，儿童比成人更常见。CBF-MYH11融合基因：存在于8
18、-9%的AML（急性髓细胞白血病）病人中。,一些较常见的白血病融合基因（续）,例：BCR-ABL融合基因,t(9;22)(q34;q11)，费城染色体（ph染色体）见于95以上的CML，1530%的成人ALL和25%的儿童ALL中 9号染色体的断裂点通常相同，但22号染色体断裂点具有异质性。根据22号染色体断裂点的不同，形成不同的BCR-ABL融合基因亚型，如e1a2，b3a2和b2a2等，相应地产生了不同的融合蛋白P190，P210等实时荧光定量PCR技术可定量检测此类融合基因,CML t(9;22)(q34;q11),NPM1：核仁磷酸蛋白(NPM1)是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一,N
19、PM1能穿梭于核仁、核质和胞质之间,参与核糖体前体运输和合成及中心体的复制,进而调控细胞的周期进程和增殖发育。在肿瘤形成过程中发挥重要作用。NPM1基因突变主要累及第 12号外显子,突变的类型多变，大多为插入突变（插入4 bp）。NPM1突变患者的预后明显好于无 NPM1突变的 AML患者；无事件生存、无复发生存、无病生存时间明显延长，总生存率明显增加,并且这些预后指标与化疗方案的选择无关。,一些较常见的白血病突变基因（续）,C-kitC-KIT 蛋白是型跨膜蛋白酪酸激酶受体蛋白家族成员之一，SCF/C-KIT 信号转导通路的异常激活与各类细胞的异常增殖有密切关系，c-kit 基因突变导致其活
20、化不依赖于受体配基结合 从而使得细胞出现异常增殖，导致肿瘤的发生。在白血病中 c-kit 突变主要存在于 exon8和17，其中 exon8 主要表现为缺失突变，其中第 419氨基酸的缺失(D419del)约占 exon8 突变的 93%，而exon17 主要表现为置换突变，其中主要的置换突变是 D816V,约占 exon17 突变的 90%左右。c-kit 基因突变在 t(8;22)的 M2b 或inv(16)和 t(16;16)的 M4 型急性白血病中常见，伴有 c-kit 突变的 AML 患者复发率高、生存期短。,一些较常见的白血病突变基因（续）,DNMT3ADNA 甲基转移酶 3A（D
21、NMT3A）能催化甲基基团加入到 CpG 岛的胞嘧啶残基，导致基因的甲基化。异常的超甲基化被认为在恶性血液系统疾病的发生中具有重要作用.AML 患者中DNMT3A 全基因组的突变比率达22%，突变形式也多种多样，主要位于DNMT3A 的3 个保守区域，热点突变是发生于882精氨酸位点的错义突变,DNMT3A 基因突变的患者还可合并有其它突变，如 NPM1、FLT3、CEBPA、等，但无论是否合并 NPM1 或 CEBPA等提示预后良好的指标，患者均表现为预后不良，说明 DNMT3A 基因突变为一独立的预后指标。,一些较常见的白血病突变基因（续）,CEBPA髓系转录因子CCAAT 增强子结合蛋白
22、-A(CEBPA)在造血系统中只表达于髓系细胞，是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用；其突变区域较宽，突变类型较多，以插入或缺失突变为主；与 NPM1基因一样，CEBPA 阳性患者有较好的无病存活率或总生存率,一些较常见的白血病突变基因（续）,三、分子诊断在法医学中的应用,在司法鉴定方面的应用,亲子鉴定PCR+片段分析个体识别,法医学DNA检测的主要目的：个人识别和亲子鉴定。分子基础：短串连重复序列(STR)的多态性。,短串联重复序列,目前在亲子鉴定中应用最广的长度多态性遗传标记。重复单位短，仅27bp长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异,Y染
23、色体复合扩增（父系鉴定）,常染色体复合扩增（Normal 19；min：15）,BloodSemenSalivaUrineHairTeethBone,CPI(累计亲权指数)为1623410000,四、分子诊断在其它方面的应用,在遗传病分析方面的应用,性分化异常(SRY基因)实时荧光PCR方法脊肌萎缩症连接酶依赖的探针杂交技术遗传性脊髓小脑性共济失调(MLPA)亨廷顿舞蹈症进行性肌营养不良症 强直性肌营养不良症 甲型血友病-地中海贫血-地中海贫血斑点杂交技术Y染色体微缺失检测 多重PCR技术,21三体(47,XX,+21),HLA抗原配型（1）HLA-I类基因配型：供、受者间HLA-A和HLA-
24、B相配的位点越多（4个中的4个或3个），则移植物存活率越高。HLA-C相配对延长移植物存活无明显重要性。（2）HLA-II类基因配型：不论HLA-A和HLA-B配合情况，HLA-DR配合均十分重要。,移植配型,每个人是不同的大多数病人的治疗方案是相同的医药费:数以万计的钱花在没有疗效的药物治疗,药物个体反应的差异,相同药物,相同药效?,相同临床表现相同实验室检查结果相同疾病(?),相同药物.,不同的疗效,?,不同的遗传背景,可能的原因:药物-药物的相互作用.药物代谢药物靶点的易感性Or.,HLA-B*1502等位基因_卡马西平,Doctor Examines Patient and Makes
25、 Initial Diagnosis,Genetic Analysis,Laboratory Buccal Swab or Blood Sample,A possible future.,临床分子诊断实验室设备与开展的工作,在病原微生物方面,快速鉴定实时荧光PCR方法淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、结核杆菌、高危型HPV病毒、HSV病毒等定量分析实时荧光PCR方法HBV、HCV、HIV、BK、EB、HCMV等病毒分型测序法HBV病毒分型、HCV病毒分型耐药分析HBV病毒四种耐药分析测序法结核杆菌耐药基因突变分析探针杂交技术,在肿瘤及血液病方面,诊断JAK2V617F突变检测实时荧光PCR方法白
26、血病融合基因筛选（BCR-ABL、PML-RARa等）IgH及TCR基因重排分析PCR+毛细管电泳个体化治疗高敏法EGFR基因29种突变分析实时荧光PCR方法高敏法Kras基因7种突变分析,在遗传病分析方面,性分化异常(SRY基因)实时荧光PCR方法脊肌萎缩症连接酶依赖的探针杂交技术遗传性脊髓小脑性共济失调(MLPA)亨廷顿舞蹈症进行性肌营养不良症 强直性肌营养不良症 甲型血友病-地中海贫血-地中海贫血斑点杂交技术Y染色体微缺失检测 多重PCR技术,在司法鉴定方面,亲子鉴定PCR+片段分析个体识别,研究主要方向,1、病毒感染分子机制研究 2、结核感染的分子机制研究 3、肿瘤分子诊断标记的研究 4、遗传病技术平台的建立和完善以及影 像遗传学研究,
