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1、2023子宫内膜类器官研究迸展摘要子宫内膜类器官(endometrialorganoids,EOs)是子宫内膜细胞自组织的三维聚集物，代表子宫内膜的结构和功能。根据所包含的细胞类型的数量，EOs可分为两类：单种细胞EOs和多种细胞EOsoEOs将加速我们对子宫内膜发育和疾病的分子和细胞机制的理解，将成为从疾病建模到个性化医疗等生物医学应用的有前途的工具。本文对EOs的表型(典型的表面标记和结构遗传特征、培养基、对激素的反应、模拟的疾病模型、挑战和未来展望逐一综述。近年来，基于更先进的干细胞和三维培养技术，类器官技术在多学科研究领域得到了广泛应用。类器官作为一种新型的研究模型，已被应用于肝、小肠
2、、结肠、胰腺等多种疾病的研究，并已扩展到子宫内膜。类器官是指将来源于人类或动物组织的具有干细胞潜能的细胞，放置在三维培养系统中的水凝胶(如基质凝胶)中，并添加适当的外源因子，从而形成类似相应器官来源的组织结构，能够在体外模拟或再现一系列体内的生理病理过程，具有相对稳定的表型及遗传学特征，可作为临床前-临床的疾病研究模型。类器官的细胞来源主要是组织特异性的成体干细胞或多能干细胞(pluripotentstemcells,PSCs),其中PSCS包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞(inducedPSCs,iPSCs)1o根据来源不同,类器官通常分为正常组织类器官、胚胎干细胞及iPSCs类器官和肿瘤类器
3、官三大类。类器官提供了体内生物学的简化模型，使在不同的环境下研究组织功能、进行高通量筛选、药物测试和生物库成为可能20子宫内膜与许多妇科问题有关，这些疾病包括不孕症、薄型子宫内膜、妊娠障碍、子宫内膜异位症、子宫内膜增生、子宫内膜癌(endometrialcancer,EC),严重影响女性健康。研究与子宫内膜生物学相关的细胞和分子机制，需要适当的体内和体外模型，现有的研究模型存在明显的不足。在体内研究中，非人灵长类和啮齿动物的应用最为广泛3o非人类灵长类动物提供了一个与人类生理相似的模型，可以研究有月经来潮物种的特有变化过程4L但是高成本、要求较高的技术和基础设施是使用非人灵长类模型的主要限制。
4、啮齿类动物，在允许组织特异性基因操作上具有优势，是研究子宫内膜容受性和胚胎着床的常用实验模型5o然而，这些模型不能准确地再现人类子宫内膜发育和功能的所有特征。以蜕膜化为例，灵长类动物的子宫内膜以周期性方式自发蜕膜化4,而啮齿类动物的子宫内膜蜕膜化仅在植入胚胎或机械损伤时发生60因此，用啮齿动物模型获得的结果往往不能直接用于人类。在体内，细胞处于复杂的微环境中，广泛的信号传递和相互作用是建立、维持和调节细胞表型和功能的关键。在大多数细胞生物学研究中，二维单层细胞培养用于体外研究。但是，在二维单层培养中，细胞间的相互作用仅限于水平面上，由于细胞与培养基直接接触，细胞暴露于浓度均匀的因子中。相关研究
5、部分解释了二维细胞培养系统无法重现体内观察到的药物筛选结果7-9o二维单层培养的原代子宫内膜上皮细胞(endometrialepithelialcell,EEC)不易高效传代，三维结构和细胞间的相互作用消失，导致细胞功能和细胞表型扭曲。永生化的子宫内膜细胞系,如Ishikawa细胞(来源于子宫内膜癌上皮细胞)或12Z细胞(来源于子宫内膜异位症上皮细胞)10-11,很容易长期培养，但这些细胞系不能忠实地模拟体内情况，特别是因为它们的表型转化,在培养中失去柱状表型和极性。与二维细胞培养系统相比，三维类器官培养系统的细胞更接近于体内组织的结构和功能特征。因此，类器官代表了一个很有前途的模型系统，它可
6、能弥补二维培养和体内模型之间的差距。本文着重就子宫内膜类器官(endometrialorganoids,EOs)的研究进展进行简要综述。一.EOs概述在20世纪80年代后期之前,大多数人子宫内膜细胞的培养都是二维培养体系；自20世纪80年代以来，人类子宫内膜三维细胞培养模型被开发和完善，以研究上皮功能、基质细胞蜕膜和胚胎-子宫内膜相互作用12o2017年,Turco等13和Boretto等14首次报道了被认为是真正意义的人类和小鼠子宫内膜上皮类器官(endometrialepithelialorganoid,EEO)0在此基础上，Boretto等15和Fitzgerald等16进一步研究了人类
7、EOs的特征，涉及正常和异常子宫内膜的类器官。这些研究描述了EOs培养基的具体组成、表型(典型的表面标记和结构)和遗传特征以及对激素的响应。EOs是子宫内膜细胞自组织的三维聚集物，代表子宫内膜的结构和功能。EOs呈球状，中央腔被单个上皮层包围。它们具有细胞异质性、自组织性、染色体稳定、克隆能力，并且腺体标志物（MUC1、ECAD、KRT7、EPCAMxFoXA2和Pan-KRT）的表达特征与体内腺体的类似13-14oEOS可以通过增生期、分泌期、更年期和妊娠期子宫内膜（蜕膜）牢靠地建立，成功率高130人子宫内膜由上皮和间质构成。上皮包括单层假复层的管腔上皮和分枝柱状的腺上皮，间质包括大量的间质
8、细胞、血管、神经纤维和白细胞，由于上皮细胞是无血管的，间质细胞起着支持作用，为上皮细胞的功能提供了合适的环境。子宫内膜不同于其他器官，子宫内膜是高度动态的，其再生、生长和分化受到卵巢激素周期性变化的精细控制。子宫内膜细胞的形态、超微结构和生化特征在整个月经周期中变化很大。长管状腺体从子宫肌层边缘向上延伸，在子宫内膜表面开放，被管腔上皮覆盖。腺上皮主要由柱状分泌细胞组成，腺体开口处有少量纤毛细胞。腺上皮和非纤毛管腔上皮EPCAMxCDHl和KRT7均呈阳性。管腔上皮包含乙酰化CC-微管蛋白+纤毛细胞和PAX8+分泌细胞。子宫内膜表面下方和子宫内膜腺体之间的基质含有CD10+、波形蛋白+间充质细胞
9、，这些细胞在妊娠期间发生显著变化。基底腺表达在其他组织干细胞/祖细胞中发现的标志物,包括SOX9、阶段特异性胚胎抗原I（StageSPeCifiCembryOniCantigenl,SSEA1）和CDH217o1. EOs分类：根据所包含的细胞类型的数量，EOs可分为单种细胞EOs和多种细胞EOso单种细胞EOs是通过将EEC或祖细胞/干细胞包埋在基质凝胶中形成的13-14,18-19,早期的EOs都是单种细胞EOs,涉及的细胞主要是EEC,因为原代EEC在原代培养中很难维持，在二维单层培养中失去极性。单种细胞EOs实际上形成的是EEO,细胞最终在管腔周围形成由极化的柱状上皮细胞组成的腺状结构
10、。使用Matrigel方法生成的EEO包含管腔上皮和腺上皮多种上皮细胞类型的混合物,包括增殖型、纤毛型、无纤毛型、干细胞型和分泌型16,2OJo大量的研究通过免疫组织化学、电子显微镜、阵列比较基因组杂交(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)和转录组分析，以及离子通道功能和纤毛发生,对获得的EOs进行了验证，证明了结果的可靠性16,19-240上皮细胞和间质细胞都是子宫内膜的主要组成部分。人类子宫内膜的典型模型需要同时包含子宫内膜间质和上皮细胞,因为间质-上皮细胞的通讯对上皮细胞的形态发生和功能非常重要，因此需要包括这两种细胞类型、更复杂的EOs,
11、即多种细胞EOso2020年Wiwatpanit等25首次生成了包含上皮细胞和间质细胞的完整EOs。这种EOs系统的一个独特特征是没有使用外源性基底膜基质，而是在微模压琼脂糖凝胶中生成多种细胞EOS。这些类器官显示出独特的组织结构,极化的上皮细胞排列在外表面，基质细胞位于类器官的中心。Abbas等26发表了一种基于MatrigelEEO的多种细胞EOs的开发方法。他们使用三维多孔胶原蛋白支架，通过控制冻干来指导EEO和基质细胞的细胞组织。首先，通过冻干法制备多孔胶原支架，支架的内部孔结构针对基质细胞进行了优化，最佳平均孔径为101rno然后将基质细胞与EEO在支架中共培养。EEO在支架表面形成
12、管腔样上皮层，上皮细胞极化，其顶端面向孔隙，其底面紧贴支架。研究还表明，这两种细胞类型都可以很容易地从支架中移除以进行下游分析。上述多种细胞EOs模型可用于研究基质-上皮相互作用、沟通及其在子宫内膜生物学功能中的作用。2. EOs培养基：直到最近，人类子宫内膜来源的类器官才成功地通过定义培养基获得13-14,20o与Wm在子宫发育和子宫腺形成中的作用一致，EOs在含有Wnt信号激活齐U(RSP01、Wnt3A和CHIR99021)和生长因子(EGFxHGF和FGF10)的培养基中繁殖，以促进增殖。添加转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)和骨形态发生蛋白(bo
13、nemorphogeneticprotein,BMP)信号通路抑制齐!l(分别为A83-01和Noggin)防止分化,添加烟酰胺建立类器官13-14,200EEO培养基成分详见表1。*1EEO培养基组成参与文献成分作用14Elradiol-17促进内内膜细胞的生K和犷张14,16.20834)lAIkMV5化学抑制耦M断TGFB途年以抑制湖胞分化20CIIIR99()21精炼合成前激懒3B抑制剂13-14.16.20ECF生长因于促分熨原I3-I4J6KGHO生长因子促分裂原16HGF生长因子促分裒源13-14.16.202PphMitriH含力独岛兴.转秩蛋白.孕用、腐胺.i,促进细胞分化和
14、存活13-14.16N-arrhl-l.-yMeine防止细*凋亡的抗辄化剂13-14.16Nicolinamkk维生44B3的酰胺衍小物,川干胚胎细据知诱导多修I细匐的分化13-14.16.20N*ggin抑制TGFB珈家族成员的分泌指门,如RMP4.抑制细胞分化20PGE2通过MMP发出信号的前列膘索13-14.16.20RSPOI作为LGK如6受体的配体,促进细胞增用并抑;WT(；FBr号.从而激活典型“mr号通路14SB2O2I9O门8MAPK的化学抑制剂.促迸细胞生长14Wnt3A激活Wnt信号通路并介导I细腿自我更新的分泌馥门13-14.16Y-27632lM：k抑制剂的化学抑制剂
15、.增谀细附。活和更新注：EEO示广宫内*1:皮类修有;E(；F示二皮生长IaFGFIo示应舒长因FKhHGF示维肝细胞生长因f；EGE2示前列腺素E2:RSP示Vm激活因FRFNMMiin1：TGFB示转化生长因FB：BMP示廿形态发力JfFhCAMP东用HflSlK3. EOs对激素有反应：人子宫内膜的重塑是动态的，主要由卵巢类固醇激素雌二醇和孕酮控制。而在二维培养系统中，EEC通常不会对激素产生反应。EOs通过对雌激素和孕酮的反应再现了人类子宫内膜的形态和功能，模拟了整个月经周期和早期蜕膜。雌二醇处理后的EOs再现了增殖期的特征，EOs用雌激素治疗可增加Ki67+细胞的数量,Ki67+细胞
16、是增殖阶段的标志14,并刺激纤毛细胞的产生20o随后的雌激素和孕酮联合处理再现了分泌期的特征，导致其受体雌激素受体(estrogenreceptor,ERa)和孕激素受体(progesteronereceptorzPR)的核表达，并产生特征性分泌期蛋白、孕激素相关子宫内膜蛋白(progestogenassociatedendometrialprotein,PAEP)和分泌性磷蛋白1(secretedphosphoprotein1,SPP1)o蜕膜化基质泌乳素和环腺苗酸(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)和胎盘人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgo
17、nadotropin,hCG)、人胎盘催乳素(humanplacentallactogenzhPL)信号进一步刺激模拟了妊娠早期，EOS获得蜕膜腺的典型表型，合成大量PAEP和SPP1,产生更多纤毛,下调祖细胞标志物S0X9130二.EOs模拟的疾病模型1 .子宫内膜异位症：子宫内膜异位症影响10%15%的育龄妇女，70%的慢性盆腔疼痛妇女和20%50%的不孕症妇女。由于对其病因和发病机制的了解有限,目前的治疗只能提供暂时而不是永久的治疗。BorettO翱15基于美国生殖医学学会修订的分期系统，从子宫内膜异位症患者不同临床阶段(IIV)中建立了患者匹配的EOs,即异位子宫内膜类器官(ectop
18、ic-endometriumorganoids,EcEOs)和在位子宫内膜类器官(eutopic-endometriumorganoids,EuEOs)0与来自EUEOS和又寸照子宫内膜的类器官相比，EcEOs也表现出ERO和PR的表达,微绒毛和纤毛指向管腔，并向管腔分泌黏液。然而，EcEOs包含较厚的管腔边缘细胞层和分层上皮，并显示上皮细胞浸润，这在正常类器官中没有观察到。与健康子宫内膜类器官相比，子宫内膜异位症类器官的整合素、磷脂酰肌醇3K酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)-AKT和Wnt等信号通路发生了改变。此外，严重的IV期子宫内膜异位症衍生的类器官具有E
19、C相关突变，表明癌症驱动基因如KRAS参与了子宫内膜异位症的进展。将子宫内膜异位类器官移植到免疫功能低下小鼠的肾包膜中，或通过腹腔注射进行原位注射，导致子宫内膜异位症典型病变的生长。WiWatPanit等25和Abbas等26连续发展了包含上皮和基质的类器官，用于研究子宫内膜异位症。最近，Esfandiari等27使用染色质免疫沉淀阵列分析正常、在位和异位子宫内膜活检标本以及异位和在位子宫内膜异位症类器官中HOX簇(AD)和HOX辅因子的甲基化水平。与正常子宫内膜相比，大多数HOX簇(AD)和HOX辅因子在异位/在位子宫内膜组织和异位/在位子宫内膜异位症类器官中显示甲基化改变。这些甲基化改变在
20、异位/在位组织活检标本和大多数的异位/在位子宫内膜异位症类器官基因中具有相同的模式。2 .EC:EC是美国最常见的妇科恶性肿瘤,也是女性第四常见的恶性肿瘤。为了提供更准确的EC绘制，研究小组开始从EC肿瘤样本中建立类器官13,15,28-29Jo除了子宫内膜/EC标志物的肿瘤类器官的蛋白和基因表达特征，如ERaPR、CKAE1AE3xCK7、CK20、MUC1、SOX17xCDCD44和/或醛脱氢酶1,Pauli等29和Boretto等15两项研究还定义和验证了EC来源的类器官的基因组学和转录组学；检测了类器官对经典化疗药物(5-氟尿Il密碇、卡粕、紫杉醇和阿霉素1PI3K抑制剂、哺乳动物雷帕
21、霉素靶点抑制剂和组蛋白去乙酰酶抑制剂的敏感性。Boretto等15从不同级别和进展阶段的EC中建立了子宫内膜癌类器官(endometrialcancerorganoids,ECOs),显示ECOs形成效率远低于其他子宫内膜疾病衍生的类器官，并且在培养中显示出有限的扩张能力。来自低级别原发肿瘤的ECOs比高级别ECOs表现出更多的腺体样特征和更明确的管腔。总之，这些ECOs准确地捕捉了肿瘤的异质性和突变情况，重现了疾病表型，并显示了患者特异性的药物反应。这些EC衍生的类器官将来可能被用于建立生物库，用于药物筛选和研究突变变化，并可能取代患者衍生的异种移植小鼠模型的使用，并降低与体内模型相关的总成
22、本。3 .子宫内膜增生：子宫内膜增生通常先于癌症的发展。Boretto等15从增生性子宫内膜建立了增生性子宫内膜类器官(hyperplasticendometriumorganoids,HypEOs),形成效率70%,起源于3个不同的亚型：简单良性、复杂非典型和息肉。这些类器官显示了相当大的增殖活性，可以长期传代(超过6个月工HypEOs显示分层的PanCK+上皮排列在中央管腔内，忠实地再现了原代组织的分子和亚细胞特征(如P53和黏液的存在/缺失除此以外，Boretto等15从Lynch综合征患者的子宫内膜增生活检组织中也建立了能够长期扩增的类器官。Lynch综合征是一种遗传性癌症易感性疾病，
23、主要发生在结肠和子宫内膜，患者通常有DNA修复基因突变300Lynch综合征EOs靶向重新测序表明，影响错配修复(mismatchrepair,MMR)基因(MSH2和MSH6)的特定突变保留在相应的类器官中。因此,HypEOs再现了疾病表型和遗传学，将有助于探索增生表型及其向癌症发展的分子机制。4 .子宫内膜炎：女性生殖道感染的微生物对子宫内膜的定植与妇科和生殖健康的并发症有关，包括子宫内膜炎、盆腔炎、早产和自然流产，对公共卫生造成重大影响。子宫内膜曾被认为是无菌环境，但新的数据证实子宫内膜有微生物组31-32L因此，EEO为研究EEC与微生物的相互作用提供了机会。Lniewski等33开发
24、了一种人体三维EEC模型,概括了人类子宫内膜上皮组织的几种功能/结构特征，包括细胞分化、连接复合体/桥粒和微绒毛的存在以及膜相关黏蛋白和Toll样受体的产生。用共生菌和致病菌：乳杆菌、阴道加德纳菌和淋病奈瑟菌感染EEC模型。所有的细菌都能有效地在三维EEC模型中定植，其中大多数是在缝隙和褶皱处。这些现象在传统的单层培养中无法检测到。在感染淋球菌后产生促炎细胞因子和趋化因子。其后，taniewski等34用扫描电子显微镜证实了淋病奈瑟菌诱导三维EEC发生显著的超微绒毛结构改变。Wendel等35也证明了与单层的细胞培养相比，三维模型更好地再现了子宫内膜异位症的高度炎症微环境，为了解子宫内膜异位症
25、相关炎症的发病机制提供了视角。因此，利用EOs三维模型再现了先前在人类子宫内膜二维培养物中未观察到的体内宿主-微生物相互作用。5 .多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS):PCOS是一种常见于育龄妇女的疾病，与许多内分泌和代谢并发症相关，包括增加EC的风险。最近，Wiwatpanit等25建立了由人类EEC和基质细胞组成的新型无支架多细胞EOs模拟PCOS中雄激素升高对EOs的影响，结果显示PCOS中过量雄激素促进EOs细胞增殖和与增殖和迁移相关的基因失调,揭示了PCOS相关的EC癌变风险新机制。综上所述，EOs具有以下优势36:模拟子宫内膜的表型特征，
26、如几种典型上皮标志物(EcadherinsPanCKxMud和EPCAM)和ERaPR的表达，形成黏液、微绒毛、纤毛和腺体极化；在遗传学上保持原子宫内膜的特征在转录组和遗传学水平上揭示了疾病相关的特征；通过表型和遗传变化，对激素(雌二醇、孕酮、cAMPxhCG、hPL和PRL)有反应；长期扩增、冷冻保存和解冻可以保持表型和遗传学的稳定性,综上所述EOs有望成为未来理想的妇科疾病和妊娠模型。四.挑战和未来展望目前，类器官在女性生殖系统研究领域的应用是一个新兴领域，虽然EOs有很多优点，但目前也存在许多局限，面临许多挑战：还需要改进细胞外基质（extracellularmatrix,ECM1迄今E
27、Os培养方案的主要限制是需要动物来源的和化学上未定义的ECM,这可能会限制高通量筛选，并由于医疗立法而妨碍直接移植。例如目前应用最多的ECM是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中纯化的MatrigelzMatrigel没有化学定义，而且每批之间都有差异。而在使用类器官进行移植时，应避免来自可能具有免疫原性和携带病原体的动物体ECM。改进办法可以考虑使用其他细胞外基质水凝胶如PEG水凝胶、胶原蛋白支架、琼脂糖等。在不同性质的子宫内膜中，类器官形成的效率是不同的。健康EOS和EuEOs（均为100%）均高于HypEOs和EcE0s（分另U为70%和60%）,而ECOs（40%）是
28、效率最低的15o这就需要进一步研究类器官形成的效率及其机制，优化不同细胞的培养基，做到长期的可扩展性、基因组和转录组的稳定性，同时提高类器官培养的效率。共培养模型还远远不够成熟和令人信服，因为这些模型还不能确定是否可以在表型和基因型上长期稳定培养。目前组织衍生的EOs主要由上皮细胞群组成，缺乏基质细胞、免疫细胞和神经细胞、肌肉细胞以及血管的共培养，而这些细胞也是疾病发展的关键。结合多种细胞类型的跨学科方法，如生物工程，将有助于发展多种细胞的共培养模型。其他创新，如生物反应器的使用和优化培养基组成,可以最大限度地减少培养条件的变化；利用三维生物打印技术、微流控技术、器官芯片（Organ-On-a
29、-chip,OOC）,可能改善组织结构;CRISPRCas9和基因编辑技术、单细胞RNA-seq技术以及光片显微镜三维活细胞成像技术的最新进展将极大地促进类器官在生物医学研究中的应用。总之，解决上述挑战将为生物医学研究开辟新的途径。综上所述，类器官提供了一个令人兴奋的时代，EOs的进展代表了子宫内膜生物学的一个激动人心的时期，这将加速我们对子宫内膜发育和疾病的分子和细胞机制的理解，EOS将成为从疾病建模到个性化医疗等生物医学应用的有前途的工具。尽管在开发真正模拟子宫内膜生理学，建立复杂EOs方面仍存在重大挑战，在生物学家、生物工程师、临床医生共同携手下，随着尖端技术的进步，战胜挑战仍然有着巨大
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