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1、2023聚类规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统用于单纯疱疹病毒治疗的研究进展单纯疱疹病毒（HSV）是一种双链DNA包膜病毒,主要通过感染机体的皮肤和神经组织致病，对人体造成严重的危害。HSV因存在潜伏期与再激活作用状态，因此如何对其进行快速检测及根治一直是临床治疗的难点。近年来，聚类规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白9系统由于其设计简单、靶向效率高，因而在基因编辑和检测领域发展迅速。人类单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）是一种嗜神经性的双链DNA包膜病毒，具有存在广泛且传染性强的特点。HSV可分为HSV-1和HSV-2这2个血清型，HSV-1主要感染面、脑及腰以
2、上部位，HSV-2以生殖器及腰以下部位感染为主。常见的临床表现为黏膜或皮肤局部的疱疹。初次感染后，大多数患者呈现潜伏感染，并无明显症状。而当患者受外界刺激后，则可引起复发。值得注意的是，HSV-2感染可能是增加人类免疫缺陷病毒和浸润性宫颈癌感染风险的重要因素1；其次，有研究发现HSV-1侵入中枢神经系统可能会引发慢性神经系统疾病（如阿尔茨海默病）I;同时，在HSV引起的急性中枢神经系统感染中，单纯疱疹病毒脑炎是儿童急性散发性脑炎最常见病因，也是患儿出现急性抽搐及继发癫痫的重要原因【3】。因此，HSV不仅具有广泛致病性，并且会由于误诊和漏诊而导致严重的后果。早期精准诊断是发现HSV感染，并避免其
3、引起严重并发症的关键。目前主要用阿昔洛韦等核苗类似物治疗原发性HSV及其引起的各类并发症，但是该类抗感染治疗仅能对HSV起到抑制作用，降低疾病复发的持续时间、严重程度和频率,并不能根治HSVoHSV诊断主要依赖病原学检测、核酸检测和血清抗体测定3种手段，但这3种检测方法仍存在或多或少的弊端。因此，临床上亟须一种快速、简便、灵敏度高的技术手段，能实现HSV的快速诊疗。聚类规则间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRlSPR基因座)及其相关蛋白(Cas基因簇)，是原核生物普遍存在的获得性免疫防御系统。当受到外
4、来病原体刺激时，细菌通过该系统将入侵病原体基因整合到基因组中。而当病原体再次入侵时，细菌将利用这一获得性免疫机制，产生针对入侵核酸的免疫应答。近期，CRISPR基因座/Cas基因簇(CRISPR/Cas)系统的发展，有望为实现HSV快速诊断提供了一种崭新的分子生物学策略，能有效减少患者的并发症、提升患者生活质量，并对深入开展HSV的特性及致病机制研究具有重要意义。一.HSV的分子生物学特性(一)HSV的结构特征及其感染机制HSV病毒主要由被膜蛋白、核心、囊膜、衣壳等结构组成，其基因组由长独特区域(uniquelong,UL)和短独特区域组成，两侧是反向重复序列【41。初次感染机体的HSV生命周
5、期如图1所示：HSV病毒粒子进入上皮细胞后，包膜糖蛋白和含有线性病毒基因组的衣壳释放到细胞质中，从而实现病毒内容物的胞内释放（I期）5；释放后的病毒基因组-核衣壳复合体在运动蛋白介导的细胞骨架重排作用下，沿细胞质中的细胞骨架运送至细胞核（U期）【6】；病毒基因组随后通过核孔复合物注入细胞核，并通过环化开始级联转录（In期）【7】，进而完成衣壳组装和病毒粒子的形成（IV期）；新合成的基因组被包裹在衣壳中形成包膜病毒体，最后释放回机体感染其他部位或是潜伏于患者体内（V期）。随后，HSV进入外周神经元，将病毒DNA释放到细胞核中，导致宿主细胞沉默，病毒基因组转录建立潜伏期【2】。充分了解该病毒的感染
6、机制将有助于阐明其他嗜神经病毒的发病机制，且有助于开发HSV基因治疗载体，为治疗复发性疱疹感染提供新抗病毒策略。HSV能否成功感染机体的关键在于HSV潜伏与再激活过程。在：I期MR对侵人.克龙人椎，m明tell喧内W因电磔，NIRW衣充电装与.V明ew=a袤加并加图1HSV的生命周期(=)HSV感染机体的潜伏期与再激活过程在HSV核内复制的过程中，基因以级联方式实现依次表达。这一过程可分为三大类：即刻早期、早期和晚期病毒基因8,其中IE在潜伏期及重新激活过程中起重要作用。病毒潜伏于支配原发感染部位的感觉神经元中，当机体受到外界刺激时诱导发生再激活，并通过轴突的顺行运输到达外周，导致反复的HSV
7、感染以加速传播。潜伏期状态主要依赖相关转录本(latencyassociatedtranscripts,LAT)以及小RNA和miRNA维持9,而潜伏期病毒的重新激活则主要通过去除神经生长因子、细胞蛋白ICPO完成1。LAT是HSV诊疗过程中的关键靶点之一。在诊断方面，LAT具有序列的高丰度性和检测的简便性的特点，可作为HSV感染的检测标志物；而在治疗方面，降低神经元中的LAT水平同样可以降低处于潜伏期内的病毒再激活能力【11】。因此，如何利用LAT区分两个时期潜在靶点的新型诊疗技术是目前的研究趋势。综上所述，HSV潜伏期和裂解复制不同感染状态使病毒诊断及治疗更加复杂化。传统方法在检测低表达水
8、平的潜伏基因时存在一定的局限性,成为HSV诊断治疗的一大障碍，CRISPR/Cas系统的出现有望为诊断该类疾病提供风向标。二.CRISPRCas9系统的分类及作用机制CRISPR/Cas系统根据其效应子亚基的组成不同可分为1类和2类，其中1类系统由多种核酸-蛋白效应复合物组成，而2类系统主要依赖一个类似Cas9这样的单一效应蛋白完成靶核酸识别，并执行所有效应复合物活动。在各类CRISPR体系中，2类11型CRISPR效应蛋白Cas9的研究最为深入，应用也最为广泛。CRISPR/Cas9基因编辑机制系统如图2所示该系统由Cas9核酸酶、CRISPRRNA与反式激活CRISPRRNA形成的引导RN
9、A组成口2,其中CRISPRRNA和反式激活CRISPRRNA改造后形成的单向引导RNA(singleguideRNA,sgRNA)进一步拓展了CRISPR系统的应用便利性。Cas9-sgRNA针对靶位点识别的唯一要求是在20nt靶序列的3处存在前间区序列邻近基序(Protospaceradjacentmotif,PAM)序歹INGGosgRNA的5端20nt序列与靶DNA序列互补，并在Cas9蛋白的共同作用下，完成靶核酸识别，并组装成Cas9-sgRNA-DNA复合体。图2CRISPRCas9基因编辑机制sgRNA与Cas9结合后，Cas9-sgRNA复合体被激活,即可搜寻和识别靶序列。靶序
10、列需满足以下两个条件：首先，目标位点附近需存在保守的PAM序列起到定位作用；其次靶序列的PAM被识别后需与sgRNA互补。若满足以上条件，Cas9蛋白和靶DNA结合可在sgRNA引导下进行，在靶DNA的PAM序列上游3bp处剪切，形成双链断裂的DNA【13,14双链断裂的DNA修复主要通过同源重组或非同源重组2种方式进行修复,非同源重组修复可引起DNA插入缺失和移码突变等结果，可用于基因沉默。同源重组修复在同源臂的存在下可实现精确的基因编辑【I。其中，同源重组修复方式对靶向基因治疗研究意义重大。三、CRISPRCas9系统在临床上的应用优势CRlSPR/Cas9系统目前已在临床上得到广泛的应用
11、。该系统在1987年，由IShinO等16在大肠杆菌基因发现了一个不寻常的结构，自此发现CRISPR的重复间隔序列。2002年，Jansen等”为了更好地理解这个重复间隔序列的特征结构，重新对其进行命名。近20年间，CRISPRCas9成为分子研究热点，先后揭示了CRISPR系统的分子机制及其可能参与微生物的免疫防御的特征1&19。CRISPR/Cas系统，以其特异性强、简单高效等特点迅速从基因编辑技术中脱颖而出，为体内基因编辑技术带来革命性突破。CRISPR/Cas系统与传统基因编辑技术相比最大的优势是其简便性，因为它是唯一一个具有统一因子的系统。Jinek等【2。首先揭示了Cas9使用双R
12、NA进行位点特异性DNA切割的机理，并强调了利用该系统有基因组编辑的潜力。随后,Broad研究所的Cong等【2”将CRISPR系统应用到了哺乳动物细胞内，并且该团队首次在人类细胞中成功使用CRISPR/Cas系统完成了基因编辑，证实CRISPR/Cas系统用于哺乳动物基因组编辑的易用性和普适性【22。随着CRISPR/Cas系统的不断改造使得其在基因编辑技术中显示出极大的优势，现已将该技术广泛应用于临床试验中。例如，有研究利用CRISPRCas9靶向编辑宿主细胞中的人类免疫缺陷1型病毒基因序列并切断该序列，从而根除病毒库并治愈了人类免疫缺陷1型病毒感染的小鼠23。CRISPR/Cas系统已成
13、为基因编辑领域发展最快、应用最广的技术，不仅成为体内基因编辑的研究新宠，而且也为体外诊断领域开拓了新的方向。CRISPRCas9系统与不同检测技术相结合是快速诊断传染性疾病的最大优势。Zhou等124利用Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，作为链取代等温扩增反应的开关，高效启动针对靶核酸分子的指数倍扩增。该技术具有超灵敏的靶向检测，体现了该系统与检测相结合的很好普适性特点。Xiong等25开发了一种CRISPRCas9介导的3线侧向流动检测，通过与多重逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）相结合，可实现SARS-CoV-2中的双基因快速测试。最近，基于CRISPRcas9介导的横向
14、流核酸分析(CASLFA)可在1h内的检测限度为数百份基因组样本，具有高特异性识别非洲猪瘟病毒的特点，该方法对资源匮乏或非实验室环境下的基因分析具有很大的潜力【26】。Huang等127基于CRISPRCas9内切核酸酶介导的核酸扩增，建立了一种新的CRISPRCas9触发的等温指数扩增反应(CAS-EXPAr)策略，用于快速和位点特异性的核酸检测，该技术不需要外源引物，并且具有特异性高，耗时短等特点备受关注。CRISPR/Cas系统与现有的核酸扩增、荧光法、胶体金等技术相结合时展现出巨大的优势。同时，随着CRISPR系统的不断进步,其在传染性疾病等各类疾病的核酸标志物检测方面带来了突破性的研
15、究进展。因此，基于上述研究表明，CRISPRCas9系统的优势在HSV诊疗中有着巨大的应用潜力。.CRISPRCas9系统用于HSV治疗(一)CRISPRCas9系统在HSV一般治疗中的应用CRISPRCas9系统在HSV病毒性传染病的治疗中展现重要潜力。相关研究表明，通过CRISPRCas9系统敲除部分HSV病毒基因可有效抑制HSV-1感染。目前在HSV-1基因研究中，3个最重要的片段分别是共价连接的长片段8(UL8)、UL29和UL52,三者在HSV-1裂解感染中参与复制基因，并且可以沉默基因来抑制病毒感染。一种或多种病毒复制基因的缺失可以减慢或完全停止病毒复制，先前就有研究利用慢病毒载体
16、将CRISPRCas9系统导入细胞，证实HSV的抑制效率取决于系统靶向的特定基因，但是在CRISPRCas9系统保护的细胞长期培养孵育过程中，病毒感染可能会复发28】。所以Karpov等29首次利用重组DNA（质粒）载体将CRISPRCas9系统导入细胞，结果表明，针对UL8、UL29和UL52基因的CRISPR/Cas系统显著抑制了Vero细胞中HSV-1的增殖,验证了CRISRPCas9系统不仅能抑制暴露细胞中的病毒感染，而且能在较长时间内完全抑制HSV-1的产生（裂解）感染。同样，在2020年VeIUSamy等301也通过共切质粒向细胞提供CaS9、SgRNA和同源定向修复模板，然后用H
17、SV-1感染转染的细胞，病毒为重组提供基因组骨架，导致HSV-1基因组的精确编辑。这种方法提供了很大的灵活性，实现了CRISPRCas9介导的HSV从单个核昔酸到大片段的缺失和插入的精准编辑。（二）CRISPRCas9系统在治疗HSV不同感染时期的应用CRISPRCas9通过靶向编码病毒蛋白的特定DNA序列来削弱体外活跃的HSV复制，从而消除病毒再激活的可能性。有研究通过设计一系列高效切割HSV-1DNA序列的SgRNAS并转入细胞后，发现病毒静止期仅有小片段插入缺失，而裂解期经Cas9编辑后的病毒基因组会出现小片段的插入缺失、线性化分子，甚至大量基因组序列的缺失【31,321。有研究团队还探
18、究了Cas9sgRNA切割不同时期病毒基因组的机制。因HSV-1静止期染色质结构比裂解期更紧凑，导致Cas9sgRNA在静止期不易进入DNA靶位点132,33。因此，裂解期的病毒基因组更容易被CRISPRCas9切割【28,32,34，但如何抑制静止期的病毒复发仍需深入研究【23】。这些发现有助于针对潜伏期和裂解期感染HSV的不同状态设计有效的治疗策略。CRISPRCas9系统除了可以治疗HSV外在HSV检测中也有望起到举足轻重的作用。随着医疗水平的进步，越来越多的研究团队投身于CRISPRCas9系统的检测研究中。所以，探究该系统的检测手段,有望为诊疗传染性疾病提供新思路五、CRISPR/C
19、as9系统的应用展望传统检测HSV的方法主要有病原学检测、免疫学检测及核酸检测。病原学检测作为HSV检测的金标准，可通过细胞培养获得具有生物活性的病毒毒株，但是该方法耗时长，易出现杂菌污染等问题，无法对HSV进行即时检测；免疫学检测是对患者进行血清抗体检测，但是因其无法区分潜伏感染和活动性感染，并且敏感性和特异性相对较低，导致其临床应用受限。核酸检测尽管具有灵敏度高、特异性好的特点，但是仍存在检测耗时长、实验室及操作人员要求高等缺点35,36,37基于CRISPRCas9系统检测平台的出现无疑将是诊断HSV感染不可忽视的一大进步。CRISPRCas9系统的核酸快检技术灵敏度高可检测单个分子，且
20、特异性强可用于检测单个碱基，该特征在检测HSV此类DNA病毒层面上展现出独特的优势。CRlSPR/Cas9系统联合等温扩增技术有望为临床快速诊断HSV提供新思路，也使得临床研究有了风向标。随着该技术的发展，针对HSV感染的不同时期精准检测有利于实现疾病发展程度和发展阶段的精确判断，并有利于临床指导性用药及预后治疗。尽管目前国内外尚未系统建立基于CRISPR/Cas9系统快速诊断HSV的方法，但基于CRISPRCas9系统在其他疾病的诊断中取得了迅速的发展，未来在检测HSV相关疾病也势必具有极大的应用前景。除此之外，该技术的运用可能会是诊断潜伏期及活动期HSV感染的关键，或将成为实现床旁快速诊断
21、HSV的突破口。因此，使用基于CRISPRCas9系统介导的多技术的联合应用来检测HSV是该疾病分子诊断领域的发展趋势。开发用于分子诊断的新CRISPR工具和平台有望在全球范围内重塑医疗保健并改善流行病学管理38。六.结语与展望CRISPRCas9系统由于其在靶核酸识别、切割过程中所具有的简单、快速、精确等独特优势，已被广泛应用于基因编辑和检测等领域，特别是在各类感染性疾病的快速现场检测方面日趋成熟。但是CRISPRCas9系统目前大多处于基础性研究，还未在临床研究中大规模应用，主要因为以下2个原因：一是PAM位点的限制影响Cas9系统对于靶标的识别和切割；二是这种技术存在脱靶效应。因此，研究者们可以通过对现有Cas蛋白进行合理化的改造或探索新的Cas蛋白，既可提高Cas蛋白的切割效率，又可以解决PAM位点的限制和脱靶效应等问题。同时，研究者们可以尝试将高灵敏度的信号输出方式与CRISPRCas9系统相结合,例如流式细胞术、光电传感技术、质谱等新兴技术，从而实现多通路的快速核酸检测。CRISPR/Cas系统有望成为下一代集诊疗于一体的生物传感平台的主力军，促进其在疾病诊断、微生物检测等多领域的快速发展。未来，围绕CRISPR系统在脱靶机制和拓展技术开发方面仍需进一步研究与优化，以促进其在未来发展创造更多价值。
