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1、2023顺钳诱导耳毒性的发生机制及预防措施研究进展摘要顺粕是一种广谱且高效的化疗药物，具治疗效果存在剂量依赖性，高剂量治疗受到耳毒性、肾毒性以及神经毒性的限制。耳毒性是顺粕化疗后常见且严重的并发症，极大地影响肿瘤患者的生活质量。目前尚无食品药物管理局批准预防顺粕化疗后听力损失的耳保护药物。近年来，国内外关于顺粕诱导耳毒性的研究揭示了许多新的发生机制和治疗靶点，许多候选耳保护药物显示出了良好的听力保护作用。并且新型的局部给药方式也不断优化，有望进一步转化为临床应用。顺粕是一种小分子粕类化合物，目前已成为头颈癌、睾丸癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤化疗中广泛使用的药物之一口顺粕诱发耳毒性的平均发生率约为6
2、2%,其特点是双侧、进行性、不可逆性的感音神经性听力损失2。在儿童患者中，由于顺粕化疗后在耳蜗中长时间滞留，相比成人更容易产生迟发性耳毒性3。耳毒性的症状表现为耳鸣、耳痛和耳聋。最初影响高频听力，一般发生在48kHz高频区域,逐渐扩展至低频听力。随着顺粕累积剂量的增加，永久性听力损失的风险也持续增加。据研究报道显示，在成人中，顺粕累积剂量达300mgm2时与严重听力损失相关。在儿童中，年龄5岁、较高的顺粕累积剂量(200400mgm2)和涉及耳蜗的头颅放疗是听力损失的危险因素4。听力损失影响儿童语言、认知和社会心理的发展。特别对处于前语言阶段和语言发展早期阶段的幼儿影响更为明显。在临床治疗中，
3、预防并减轻顺粕化疗后的耳毒性成为目前亟待解决的问题。本文就近年来国内外有关顺铀耳毒性发生机制及预防措施的研究进展作一综述。1耳毒性机制1.1 氧化应激顺粕经血液循环进入内耳，首先通过转运体如铜转运体1和有机阳离子转运体1-3进入耳蜗细胞,迅速形成能与细胞内DNA碱基发生反应的剧毒性水化物，导致DNA损伤和DNA交联，阻止转录和复制，发挥细胞毒性作用5。顺粕在耳蜗中的三个主要作用靶点为外毛细胞、螺旋神经节和血管纹6。耳蜗”氧化应激”一直被认为是顺粕耳毒性的重要机制之一。耳蜗中独特表达的NADPH氧化酶N0X3亚型可能是活性氧(reactiveoxygenspecies,RoS)产生的主要来源。R
4、ybak等研究表明，鼓室小干扰RNA(SiRNA)预处理抑制N0X3表达可显著保护大鼠耳蜗免受顺粕介导的氧化应激影响。此外，氧化应激导致耳蜗内源性抗氧化酶耗竭，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶等。耳蜗中氧化和抗氧化系统的失衡使ROS过度产生和累积，引起脂质过氧化、蛋白质硝化和Ca2+超载,触发线粒体释放细胞色素c,激活半胱天冬酶-3(CaSPaSe-3)和半胱天冬酶-9(CaSPaSe-9),诱导细胞凋亡。1.2 炎症顺粕耳毒性与内耳炎症刺激有关。有研究表明，炎症可能是引起耳毒性的第一个触发事件。涉及的信号通路主要包括核因子KBsUCIearfaCt
5、OrkappaB,NF-KB)途径及信号传导和转录激活子(SignaltranSdUCerandactivatoroftranscription,STAT)途径2。一方面，顺粕激活细胞外信号调节激酶(ERK)诱导耳蜗释放促炎细胞因子,包括TNF-OJL-I轿口IL-6,并降低KB抑制蛋白家族(IKB)降解来增加NF-KB的细胞核易位，放大细胞内炎症状态，如诱导促炎因子从头合成、ROS产生以及激活caspase-3和caspase-9触发凋亡2。另一方面，顺治诱导耳蜗中STAT1蛋白的表达，激活瞬时受体电位香草酸亚型I(TRPVI)和N0X3信号通路,导致Ca2+超载、炎症和凋亡相关蛋白的更强表
6、达，包括环氧合酶-2、TNF-8诱导型一氧化氮合酶、P53xcaspase-3和Bcl-2样蛋白4,并下调促进生存的STAT3表达2,7。此外，顺粕诱导IL-4和IL-13分别与IL-4受体讲口IL-13受体Od结合，激活STAT6,在耳蜗炎症反应的介导中也起着关键作用网。1.3 细胞死亡内耳细胞的氧化应激、炎症、ROS生成以及DNA损伤共同激活细胞凋亡途径。研究表明顺粕可激活耳蜗细胞中固有的细胞凋亡途径2。顺粕导致DNA损伤后通过共济失调毛细血管扩张突变-细胞周期检测点激酶2-p53(ATM-Chk2-p53)信号通路，增加Bax蛋白的表达，后者激活caspase-3,增加线粒体膜的通透性,
7、触发线粒体释放细胞色素c,诱导细胞凋亡3。在这一过程中，顺粕还可增加凋亡诱导因子以及凋亡蛋白酶活化因子1的表达，共同促进细胞凋亡2。另外，多项体外实验发现，顺粕增力口Bedin-1、LC3B-H、NLRX1等自噬标记物的表达，导致自噬小体在细胞质中积聚,诱导自噬性细胞死亡0。此外,由促进促炎细胞因子IL-I轿口IL-18成熟和分泌的炎症小体介导的细胞焦亡以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3介导的坏死性凋亡可能也与顺粕诱导的细胞凋亡有关2,9。近年来发现的细胞铁死亡是一种新的调节性细胞死亡形式，由铁依赖的脂质过氧化产物累积引起。在HEI-0C1细胞和小鼠耳蜗中，特异性铁抑制剂f
8、errostatin-1和铁螯合剂可显著减轻顺粕的耳毒性，表明细胞铁死亡可能也是耳蜗细胞死亡的途径之一10。1.4 遗传基因组学遗传学研究表明，多种基因都可能影响顺粕耳毒性的易感性，如参与顺粕药代动力学和药效学酶的变异、DNA修复酶基因的多态性以及线粒体突变基因11。目前药物基因组学数据库(PharmGKB)中收录的与顺粕耳毒性相关基因有7个，分另!J为GSTM1、GSTT1xLRP2、XPCxSLC22A2xSLC31A1和GSTP1,总结最有证据的关联基因为GSTP1rs169512o此外，根据加拿大一项研究,TPMTrs12201199和COMTrs9332377与顺柏耳毒性风险增加有显
9、著的相关性，其中TPMTrs12201199耳毒性的发生率更高12。最近的一项全基因组关联研究发现，ACYP2rs1872328以及WFS1rs62283056也均与顺粕诱导的耳毒性有显著相关性12oACYP2的耳毒性可能是影响了毛细胞内的钙稳态13o2耳保护策略2.1 抗氧化、抗炎、抗凋亡在动物实验中，大多数抗氧化、抗炎、抗凋亡药物对顺钳耳毒性都具有保护作用，如硫代硫酸钠（SodiUmthiosulfate,STS）、N-乙酰半胱氨酸、D-蛋氨酸、氨磷汀、地塞米松等。这些药物研究早,数量多，但多因全身给药能与顺粕反应形成复合物，降低了抗肿瘤活性而限制了临床应用。STS是第一个经临床试验验证对
10、顺粕耳毒性具有保护作用的药物，也是唯一被强烈推荐用于预防顺粕诱导的儿童和青少年非转移性肝母细胞瘤耳毒性的药物（高质量，强烈建议）口4。在评估STS对顺钳所致儿童和青少年听力损失预防作用的研究中,北美儿童W瘤协作组开展的ACCLo431试验是最早的一项多中心临床随机对照试验。该试验纳入了新诊断的接受顺粕治疗的多种类型肿瘤患儿，包括肝母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤等，匕瞰STS延迟给药组（即顺粕治疗后6h接受STS治疗）与单用顺钳组之间无事件生存率和总体生存率的差异。结果表明，STS可显著降低顺粕化疗后听力损失的发生率，且对无事件生存率和总体生存率无影响。但对播散性肿瘤患者，STS延迟给药组无事
11、件生存率和总体生存率低于单用顺粕组。这一结果可能与研究本身纳入的肿瘤类型范围广泛、预后分期不同以及生物学行为不同等有关。此外，STS的肿瘤保护作用可能在预后较差的个体中更为明显口5o未来需进一步研究确定STS对播散性W瘤患者治疗的安全性。为进一步验证STS对顺柏治疗局灶性肿瘤的耳保护作用的有效性，国际肝肿瘤协作组进行了SI0PEL6研究。该研究是一项仅针对标准风险组肝母细胞瘤(3个肝区受累、无转移以及甲胎蛋白100ngml)的一项国际合作随机对照临床试验。与ACCLo431试验结果一致，STS延迟给药可显著降低顺粕所致听力损失的发生率，且对无事件生存率和总体生存率无影响16。目前，STS已逐渐
12、推广到临床预防顺粕化疗的耳毒性中。未来关于STS延迟给药如何减少对顺粕抗肿瘤活性的干扰，仍然值得进一步研究。近年来，一项随机、双盲、安慰剂对照的2期临床试验证实了抗氧化剂依布硒琳(EbSelen)可安全有效地预防噪声性听力损失17。但目前关于其对顺粕耳保护作用的研究结果不一致，评估其对化疗诱导听力损失预防和治疗的2期临床试验(NCTOl451853)尚处于招募阶段5。Kim等18研究表明,抗氧化剂-硫辛酸(ALA)对顺粕治疗后的小鼠几乎具有完全的听力保护作用，且与维生素E和乙酰左旋肉碱联合使用可发挥协同效应。氟桂利嗪是一种T型钙通道拮抗剂，通过激活Nrf2HO-1信号通路显著降低促炎细胞因子的
13、分泌。在较低频率下可有效预防顺粕耳毒性,但对高于4kHz的频率则无效5。此外,近年来，一些从植物中提取的具有抗氧化、抗炎、抗凋亡作用的多酚类以及菇类物质，如姜黄素、阿魏酸、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、熊果酸、毛喉素等，因具有低毒性、化学增敏性以及靶向多途径的特性而被广泛研究。它们不仅具有耳保护作用，而且也是心血管疾病、神经退行性疾病等的有效治疗药物，部分还具有抗肿瘤活性以及预防肿瘤作用口9,20,21,22。2.2 G蛋白耳蜗中保护性G蛋白耦联受体(G-ProteincoupledreceptorszGPCRs)包括A1腺昔受体(Aladenosinereceptor,A1AR)x大麻素受
14、体2(cannabinoidreceptor2,CB2R)和I-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphatereceptor2,S1PR2)o在动物实验中，三种特异性GPCRs激动剂均可减轻顺粕耳毒性23,24,25。从作用机制方面,A1AR和S1PR2激活后以NADPH氧化酶NOX3亚型为主要靶点,抑制ROS产生来降低耳蜗中氧化应激23,25;CB2R则通过抑制STAT1依赖性炎症细胞因子的产生，以及激活JAK2/STAT3促生存信号的传导，阻断顺粕诱导的炎症和凋亡途径24。除了具有耳保护作用外根据文献报道，激活内源性CB2R还能预防自身炎症性疾病，如结肠炎、类风湿性关节
15、炎等24;S1PR2也可通过阻止顺粕诱导的螺旋神经节以及中枢神经系统脱髓鞘发挥神经保护作用25。2.3 可逆性p53抑制剂p53是一种重要的肿瘤抑制基因，也是顺钳诱导DNA损伤后激活ATM-Chk2-p53凋亡通路的关键底物。其累积和激活在耳蜗毛细胞死亡中起着关键作用。Benkafadar等26在动物模型研究中发现,p53基因敲除的小鼠对顺粕耳毒性更具抵抗力。此外，p53介导的可逆性凋亡抑制剂Pifithrin-O(PFT-B可保护耳蜗毛细胞免受Il页粕的耳毒性,甚至可增强部分肿瘤对顺粕治疗的敏感性。PFT-媚强了顺粕诱导的选择性抗血管生成和凋亡，降低顺粕诱导的自噬，可能是PFT-a台疗后顺钳
16、致敏性增强的部分机制26。顺粕联合鼓室内注射PFT-坏仅可实现有效的听力保护，且适用于以顺粕为基础的任何类型肿瘤的治疗，值得进一步临床研究。2.4 BRAF抑制剂BRAF是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RAF家族成员，其磷酸化激活RASRAFMEKERK信号传导通路，参与细胞增殖和存活，突变与多种肿瘤的发生相关。顺粕是该信号通路的有效诱导剂，在有丝分裂后的耳蜗细胞中起着促凋亡和应激激活作用27。达拉非尼是一种已被美国食品药物管理局(fdanddrugadministration,FDA)批准用于治疗多种肿瘤的选择性小分子BRAF抑制剂其抗肿瘤作用安全有效,口服生物利用度好，特别是具备易穿透与血-迷路屏
17、障相似的血-脑屏障的特性，因而拥有良好的临床应用前景。并且作为一种抗肿瘤药物，达拉非尼一般不会干扰顺粕的抗肿瘤活性，克服了大多数临床候选耳保护药物的主要障碍。在某些类型肿瘤中，达拉非尼甚至可以协同顺粕的抗肿瘤作用27。该药有望成为FDA批准的首批耳保护药物之一。IngerSoIl等27研究表明,达拉非尼和细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cydin-dependentkinase2,CDK2)抑制剂联合使用可以发挥更好的耳保护效果和更低的总体毒性。2.5 CDK2抑制齐IJCDK2是一种经典的促进细胞周期的蛋白质，顺粕通过上调其辅因子(细胞周期A)激活CDK2,促进有丝分裂后耳蜗细胞的调亡28。CDK
18、2抑制剂一直是各种肿瘤治疗研究中的焦点，最初被开发为不干扰顺粕肿瘤杀伤能力的抗肿瘤药物，目前已成为耳保护药物筛选中的一类热门药物。泛激酶抑制剂Kenpaullone以CDK2为主要抑制靶点，减少线粒体ROS产生以及caspase-3和caspase-7介导的细胞凋亡，发挥耳保护作用28。但Kenpaullone水溶性较差，只适合局部给药。第二代CDK2抑制剂AZD5438和AT7519是更有效的激酶抑制剂，二者均已进行临床研究，安全性和耐受性良好。特别是AZD5438,在体外试验中观察到，对所有听力频率范围都能提供完全的保护作用，并且生物利用度好,渗透性及水溶性高29。AT7519尽管也显示出
19、极好的耳保护作用，但在高剂量使用时疗效急剧下降。为克服这一缺点，以AT7519为先导化合物合成的类似物AT7519-7不仅耳保护效果与AT7519相当,而且在较高剂量时仍具有强大的保护效力29。在最近的研究中，Hati等30将蛋白质水解靶向嵌合体(PRoTAC)与AZD5438结合，有效地弓I导AZD5438对CDK2进行靶向降解。这种高选择特性更进一步提高了CDK2抑制剂对听力的保护效果，并且降低了药物毒性。2.6 表观遗传学调控近年来，随着对表观遗传学研究的深入，发现部分表观遗传学调控与内耳发育密切相关，一些表观遗传学因子的缺陷及突变已被证明与人类感音神经性听力损失相关，如组蛋白修饰酶、D
20、NA翻译后甲基化修饰等31。精氨酸甲基化是一种丰富的翻译后修饰，由蛋白质精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMTS)催化。He等31研究发现，PRMT6选择性小分子抑制剂EPZ020411可逆转顺粕引起的caspase-3和细胞色素C易位表达的增加，以及线粒体功能障碍、ROS累积和细胞凋亡的激活来保护听力损失。因此，了解顺粕耳毒性的表观遗传学机制并开发药物以维持合适的表观遗传学调节，可能提供一种新的方法来逆转异常基因表达谱引起的耳毒性损伤。2.7 其他一些研究初步表明，顺粕还可通过机械电传导(MET)通道、TRPV1通道和TRPV4通道进入
21、耳蜗毛细胞,可设计通道阻断剂减少耳蜗对顺粕的摄取32o此外,自噬是细胞内的一种“自我保护”机制，针对性诱导耳蜗螺旋神经元及线粒体自噬可能对顺粕耳毒性具有保护作用33,34,35。除耳保护药物外，近年来局部给药方法也不断优化，如耳蜗内注射负载泼尼松龙的磁性纳米颗粒，避免了药物局部使用快速从内耳组织清除的问题以及全身给药对顺粕抗肿瘤活性的干扰36。虾青素负载聚合物脂质杂化纳米颗粒(ATX-LPN),在保护虾青素抗氧化活性的同时，也具有良好的化学稳定性和生物相容性37。3小结和展望目前研究表明，顺粕耳毒性的作用机制可能与氧化应激、炎症、凋亡有关,遗传因素在个体易感性方面也参与作用。耳保护药物，如抗氧化剂、p53抑制剂、CDK2抑制剂、BARF抑制剂等均表现出良好的临床应用前景。新型局部给药方式更是最大限度减少了对顺粕抗肿瘤活性的干扰。未来开发新的药物靶点、优化局部给药方式仍应继续。对顺粕化疗后进行听力监测，早期识别听力下降，将更好地促进顺粕治疗后的临床收益。
