线粒体异柠檬酸脱氢酶ICDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)试剂盒说明书微法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义:ICDHm(EC1.1.1,41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三拨酸循中催化异柠檬酸生成酮戊二酸,同时将NAD+还原为NADH,是三粉酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。渊定原理:ICDHm催化NAD+还原生成NADH,导致34Onm处光吸收上升。需自备的仪器和用品紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制:试剂一:10OmLXl瓶,20C保

2、存;试剂二:20mLl瓶,-20C保存;试剂三:ISmLxl支,-20C保存:试剂四:液体20mLxl瓶,4C保存;试剂五:粉剂Xl支,4匕保存;试剂六:粉剂Xl支,2(TC保存;样本的前处理:组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:1、称取约Slg组织或收集500万细胞,加入ImL试剂一和IOUL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,42离心5min.3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4C离心IOmin。4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm(此步可选做)。5、在步骤的沉淀中加入200UL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率2

3、0%或200W,超声3秒,间隔K)秒,重复30次),用于线粒体ICDHm活性测定。渊定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定(1)在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解,置于374C(哺乳动物)或25(其它物种)水浴IOmin;用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融;(2)在试剂六中加入ImL蒸馆水,充分溶解待用:用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融;(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入IOUL样本、K)UL试剂六和180JL试剂五,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值Al和2min20s后的吸光值A2,计算4A=A2

4、-A1。ICDHm活性计算:a.用微石英比色皿测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个衡活性单位。ICDHm活性(nmol/min/mgprol)=QAxV反总(d)xl()9(CprxV样)T=16O8AACpr(2)按样本鲜重计算单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm(nmol/min/g鲜重)=AV反总(d)xlO(WxV样V样总)T=325AA+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmo

5、lmin104cell)=AAV反总(d)xl()9(5(X)xV样V样总)T=0.65MAV反总:反应体系总体枳,2104L;:NADH摩尔消光系数,6.22103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。b.用96孔板测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmol/min/mgprol)=QAxV反总(d)10

6、9(VWCpr)T=3216ACpr(2)按样本鲜重计算单位的定义:银g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个防活性单位。ICDHm(nmol/min/g鲜重)=AV反总+(d)xl04(WxV样V样总)T=650A+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmolmin104cell)=AA*V反总(d)xl()9+(5(X)XV样V样总)T=L3AAV反总:反应体系总体积,210-4L;:NADH摩尔消光系数,6.22103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。优利科(上海)生命科学褂限X

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