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1、含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定BJS2019151范围本方法规定了含乳饮料及其原料中酪蛋白四种亚型s酪蛋白、as2-酪蛋白、P-酪蛋白、K-酪蛋白含量测定的方法。本标准适用于含乳饮料及其原料中酪蛋白总含量的测定，不适用于发酵法、酶解法、水解法等工艺对蛋白质改性的样品。2原理试样溶液中的酪蛋白采用等电点沉淀后复溶，用胰蛋白醐进行酌解，同时加入同位素内标，Ci8水相柱分离，采用液相色谱串联质谱仪检测，内标法定量。3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 浓盐酸(HC1)。3.1.2 甲酸(CH2O2):质谱级。3.1.4 氯
2、化钠(NaCl)o3.1.5 乙Bf(CH3CN):质谱级。3.1.6 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4HnNO3)o3.1.7 聚乙二醇辛基苯基酸(TritonX-100,C34H62Ou)03.1.8 胰蛋白醐(Trypsin,C6H15Oi2Pa):质谱级，猪源、牛源、基因工程来源均可；建议采用基因工程级的胰蛋白酶以降低杂酶的影响。3.2 试剂配制3.2.1 盐酸溶液(6moIL):吸取25mL浓盐酸，用水稀释并定容至50mL。3.2.2 甲酸溶液(10%VV):吸取ImL甲酸，用水稀释并定容至IOmL。3.2.3 醋酸溶液(0.3%V/V)：吸取0.3mL醋酸，用水稀释并定容至IoOm
3、L。3.2.4 氯化钠溶液(0.5molL,含0.2%TriIOn-XlO0)：称取14.625g,加20OmL水溶解后，加入1mLTritonX-100(3.1.7),混匀溶解后，用水定容至500mL。3.2.5 Tris-HCl溶液(50mmol/L)：称取6.057gTris,加900mL水溶解，用6mol/L盐酸溶液(3.2.1)调PH至8.5后，用水定容至IooOmL,经0.45m微孔灌膜过滤，备用。3.2.6 胰蛋白酶液：用醋酸溶液(3.2.3)将胰蛋白酶粉末溶解至Img/mL后，按照单次使用量进行稀释分装，如每瓶50错误!未找到引用源。L或100错误!未找到引用源。L的0.2mg
4、/mL胰蛋白酶,-80。C冷冻保存，避免反复冻融。3.2.7 蛋白质浓度测定试剂盒(基于考马斯亮蓝-BradfOrd测定法或BCA蛋白质测定法均可)。3.2.8 甲酸水溶液(0.1%V/V)：吸取0.5mL甲酸，用水稀释并定容至500mL。3.3 标准品3.3.1 as1-酪蛋白特征肽标准品：Ylgyleqllr,纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.2 as?酪蛋白特征肽标准品：Falpqylk,纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.3 B-酪蛋白特征肽标准品：VLPVPQK,纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.4 K-酪蛋白特征肽标准品：YlPIQYVLSR
5、,纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.5 OSI-酪蛋白特征肽内标标准品：PSERYLGYL*(乜，叩)EoLLRLKKY.HPLC级纯度298%。3.3.6 as2酪蛋白特征肽内标标准品：RYoKFALPOYL(30.1molL0.2molL1.0mol/L2molL的系列混合标准工作液，-20错误!未找到引用源。冷冻保存，有效期1周。3.4.4 内标标准储备溶液（10molL）:根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型（3.3.533.8）称样量，精确称取适量（精确至0.01mg）内标标准品后，用Tris-HCl溶液（325）溶解，配制成各酪蛋白亚型特征肽（3.3
6、.5-338）浓度均为10molL的内标标准储备溶液，此溶液密封后20错误!未找到引用源。冷冻保存，有效期3个月。3.4.5 内标混合标准溶液：准确分别吸取0.25mL各酪蛋白亚型特征肽内标标准储备溶液（3.4.4）混合，配制成浓度为2.5moIL内标混合标准溶液1mL,20错误!未找到引用源。冷冻保存，有效期1个月。3.4.6 混合标准品酶解溶液：分别准确吸取500L各系列混合标准工作溶液（3.4.3）到2mL低吸附聚丙烯（PP）离心管中，向每个浓度中加入40L内标混合标准溶液（3.4.5）,再加入5L的0.2mg/mL的胰蛋白酶液（3.2.6）（含1g胰蛋白酶），用纯水定容至ImL后充分涡
7、旋，在1000rmin,4错误!未找到引用源。条件下，离心1min.盖紧瓶盖，在37错误!未找到引用源。水浴或者恒温箱内孵育1516h后，取出加入20L10%的甲酸溶液（3.2.2）终止酶解反应。混匀后，在10000rmin,4错误!未找到引用源。条件下离心10min,静置，取上清液备用。上清液在-20错误!未找到引用源。冷冻保存放置45天内稳定。3.5 材料3.5.1 低吸附型2mL、15mL、50mL聚丙烯（PP）离心管。3.5.2 低吸附型聚丙烯（PP）枪头。3.5.3 低吸附型聚苯乙烯（PS）96孔板（用于总蛋白含量测定）。4仪器和设备4.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源
8、。4.2 酶标仪。4.3 分析天平：感量分别为0.001g、400OIg和0.00001g。4.4 低温离心机：转速26000rmin,）4.5 恒温水浴锅或可控温培养箱。4.6 PH计。4.7 涡旋振荡器。5分析步骤5.1 试样蛋白提取含乳饮料固体试样（若含乳包装为独立包装，应与其他调味粉末混合后取样，例如：咖啡、奶茶等饮品）：试样称取Ig5g（精确至0.0OIg）于锥形瓶中；若为乳饮料液体试样：精密量取试样IOmL于锥形瓶中，加入30mL预温（40错误!未找到引用源。）的TriS-HQ溶液（3.2.5）,混匀后，放入60错误!未找到引用源。水浴恒温振荡1h,取出冷却后用TriS-HCI溶液
9、（3.2.5）转移定容至50mL容量瓶（V潘解体机）。乳粉原料粉试样：称取试样0.5gIg（精确至（100lg）于锥形瓶中；若为液体乳试样：精密量取试样l2mL于锥形瓶中，加入30mL预温（40错误!未找到引用源。）的TriS-HCl溶液（325）,混匀后，放入60错误!未找到引用源。水浴恒温振荡1h,取出冷却后用TriS-HQ溶液（3.2.5）转移定容至50mL容量瓶（V洛解体积）。精密量取IOmL（V沉淀体枳）上述完全溶解的试样溶液（视检无明显结块），按体积比（Wu=E）加入10mL氯化钠溶液（3.2.4）,涡旋振荡。混匀后，用10%甲酸溶液（3.2.2）调节试样的PH值到464.8之间，
10、28错误!未找到引用源。条件下静置过夜，待所有蛋白沉淀析出。己析出的沉淀试样在100Oormin,4错误!未找到引用源。条件下离心15min,弃去上清液，沉淀以备复溶。5.2 试样复溶向上述沉淀试样（5.1）中加入5mLTris-HCl溶液（325）,涡旋振荡5-10min,使溶液充分溶解,放入60错误!未找到引用源。水浴恒温振荡30min,取出后继续混匀（视检无明显结块）。试样溶液在100Oormin,4错误!未找到引用源。条件下离心15min,弃去沉淀，留取上清液。上述步骤重复1次，合并两次复溶的上清液后，可用Tris-HCl溶液（3.2.5）定容至IOmL（VU溶体积）。5.3 试样总蛋
11、白的含量测定按照BradfOrd或BCA法试剂盒所述方法测定复溶试样溶液（5.2）中总蛋白质的含量（单位：mg/mL）o5.4 试样的稀释为保证该实验在最佳的防解效率下进行，需根据试样中总蛋白的含量测定结果（5.3）,用TriS-HCI溶液（3.2.5）对复溶后的试样溶液进行稀释（f3的低侪故），使试样稀释液中的总蛋白含量保持在0.2mgmL0.7mg/mL之间。5.5 试样的酶解该实验的最佳的解效率为：醐的质量/总蛋臼质量（ww）=.20,根据此原则推算，若试样稀释液中总蛋白含量在0.2mgmL0.7mgmL之间，按取样量200L进行酶解（V.体枳），则其对应的总蛋白质质量范围在40g140
12、g之间，加入胰蛋白酶的量则在2g7g范围内。取200L（VM体枳）稀释后的试样（5.4）,按照上述计算依据，加入适量胰蛋白酶液（3.2.6）,向试样中加入40L内标混合标准溶液（3.4.5）,用纯水定容至1mL（V定海体税）后充分涡旋，在1000rmin,4错误!未找到引用源。条件下，离心Imin。盖紧瓶盖，在37错误!未找到引用源。水浴或者恒温箱内孵育15-16h后，取出加入20L10%的甲酸溶液（322）终止酹解反应。混匀后，在100oormin,4错误!未找到引用源。条件下离心IOmin,静置，上清液以备分析。注：当回收率达不到本标准要求时，应考虑对蛋白酶活力进行评价。可以选用市售标准蛋
13、白质质控样品（标明准确蛋白含量且己知目标肽段分子量的产品）随行酶解步骤，检测评估及控制。5.6 仪器参考条件5.6.1 液相色谱参考条件a）色谱柱：C8亲水柱（T3）,柱长Ioomm,内径2.1mm,粒径1.8m,填料孔径错误!未找到引用源。1001或性能相当者；b）流动相：流动相A为0.1%甲酸-水溶液（3.2.8）,流动相B为乙懵（3.1.5）,参考梯度洗脱程序见表1；c）流速：0.3mL/min；d）柱温：3。错误!未找到引用源。；e）进样量：5L;表1参考梯度洗脱程序时间(min)A：0.1%甲酸-水溶液（）B：乙精（%）09550.59554.550504.635656.635656
14、.79559.09555.6.2 质谱参考条件a）离子源：电喷雾离子源；b）扫描方式：正离子扫描；c）监测方式：多反应监测模式,酪蛋白母离子、子离子和碰撞能量见表2。d）毛细管电压：3500V；e）锥孔电压：10V；f）离子源温度：150错误!未找到引用源。；g）偏转电压：50V；h）锥孔气流量：150Lh;i）脱溶剂气温度：500错误!未找到引用源。；j）脱溶剂气流速：800L/h；表2酪蛋白各亚型特征肽的主要质谱参数序号化合物母离子子离子碎裂电压（mz）（m/z）（V）碰撞能量（eV）OSl-酪蛋白特征肽991*45211634.524945282s-酪蛋白特征肽（内标）638998*45
15、212494528as?-酪蛋白特征肽648*40153490.52264030as2-酪蛋白特征肽655*40154494（内标）2194018酪蛋白特征肽568*301153912133096氏酪蛋白特征肽394.5568*3011（内标）2853012K酪蛋白特征肽975*40227626.524940248K酪蛋白特征肽630492*4518（内标）2494522*为定量离子。5.7 定性判定按照上述条件测定待测液和混合标准工作液，如果试样待测液中色谱峰的保留时间与混合标准使用液中某一组分保留时间一致（变化范围在2.5%之内），试样待测液中色谱峰定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合标准
16、使用液相对丰度一致，相对丰度（k）偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在该成分。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）k50%50%k20%20%2Q10%k10%允许的最大偏差（）20%+25%30%+50%6分析结果的表述6.1 试样溶液中各酪蛋白亚型的浓度计算溶解的试样中各酪蛋臼亚型的浓度按式（1）计算:式中:”哥堡白=C-RJrfl Xf2f3(1)错误!未找到引用源。（步骤5.1中）50 mL试样溶解液中各酪蛋白亚型的蛋白浓度aSl-、aS2-0-、-, 单位为 molL;错误!未找到引用源。经标准曲线计算后各酪蛋白亚型的肽段浓度，即代表各酪蛋白亚型蛋白浓
17、度，单位为moIL;错误!未找到引用源。-（步骤5.5中）试样前解后的定容体积，单位为mL （1mL）；错误!未找到引用源。（步骤5.5中）试样稀释液的酶解体积，单位为mL（0.2mL）;错误!未找到引用源。-（步骤5.2中）复溶试样中沉淀蛋白的溶液体积，单位为mL(10 mL)；fl =错误!未找到引用源。（步骤5.1中）从溶解的试样中抽取用于沉淀蛋白的溶解液体积，单位为mL（10mL）；错误!未找到引用源。（步骤5.3中）Bradford或BCA法测定后，稀释复溶蛋白溶液的稀释因子。6.2 试样溶液中各酪蛋白亚型的含量计算试样中各酪蛋白亚型的含量按式（2）计算：Xi=错误!未找到引用源。（
18、2）式中：Xi试样中各酪蛋白亚型的含量aSl-、aS2-、-.-,单位为g100g或g100mL;错误!未找到引用源。-（公式1中）试样溶解液中的各酪蛋白亚型浓度aSl、aS2-.-.-,单位为molL;MaSl-aS2、p、K-酪蛋白的相对分子量（附录A表A.2）,单位为g/mol;错误!未找到引用源。一溶解样品的溶液体积，单位为mL（50mL）；m试样质量或体积，单位为g或者mL。注：试样中各酪蛋白亚型的含量需按照附录A表A.2中的蛋白分子量计算。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。6.3 总酪蛋白含量计算试样中酪蛋白总含量按式（3）计算：A
19、=错误!未找到引用源。（3）A-试样中各种酪蛋白亚型含量的总和，即试样中酪蛋白的总含量，单位为g100g或g/100mL；错误!未找到引用源。一试样中aSl型酪蛋白的含量，单位为g100g或g100mL:错误!未找到引用源。试样中S2-型酪蛋白的含量，单位为g100g或g100mL;错误!未找到引用源。-试样中小型酪蛋白的含量，单位为g100g或g/lOOmL；错误!未找到引用源。试样中K-型酪蛋白的含量，单位为g100g或g/lOOmL。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%8其他本方法的特征肽段、粉状及液体含乳饮料、粉状及液体乳原料的检出限与定量限
20、如下表4所示:表4仪器、方法检出限及定量限特征肽段仪器LOD/LOQs-型酪蛋白nmol/Las2-型酪蛋白nmol/L-型酪蛋白nmol/LK-型酪蛋白nmol/L检出限LOD1111定量限LOQ3333粉末状含乳饮料方法LOD/LOQ（以5g试样称取，50mL溶液定容计算）as-型酪蛋白ggas?-型酪蛋白ggP-型酪蛋白gK-型酪蛋白gg检出限LOD0.250.260.250.21定量限LOQ0.740.780.750.64液体状含乳饮料方法LOD/LOQ（以IOmL试样量取，50mL溶液定容计算）s-型酪蛋白gmLs2-型酪蛋白gmLP-型酪蛋白gmLK-型酪蛋白gmL检出限LOD0.
21、120.130.130.11定量限LOQ0.370.390.380.32粉末状乳原料方法LOD/LOQ（以Ig试样称取，50mL溶液定容计算）as】-型酪蛋白gas?-型酪蛋白gP-型酪蛋白ggK-型酪蛋白gg检出限LOD1.2131.31.1定量限LOQ3.73.93.83.2液体乳原料方法LOD/LOQ（以2mL试样量取，50mL溶液定容计算）s-型酪蛋白gmLas?-型酪蛋白gmL-型酪蛋白gmLK-型酪蛋白gmL检出限LOD0.610.650.630.53定量限LOQ1.82.01.91.6本方法的准确度如下表5所示:酪蛋白加标水平（molL）回收率（）精密度（）0.0171.07.7
22、0.0571.65.50.164.34.50.570.75.2264.75.9556.65.8附录A表A.1酪蛋白肽段标准品信息序号名称肽段序列相对分子量Mw（gmol）1OSI-酪蛋白Ylgyleqllr1267.52OSl-酪蛋白（内标）PSERYLGYL(乜，ISN)EoLLRLKKY2276.63as?-酪蛋白Falpqylk979.24as2-酪蛋白（内标）Ryokfalpoyl*(工，.N)KTVYo2053.35B-酪蛋白VLPVPQK780.06酪蛋白（内标）SOSKVL(乜，5N)PVPoKAVPY1648.07K-酪蛋白Yipiqyvlsr1251.58K-酪蛋白（内标）K
23、iakyipioyvl*(4，W)SRYPSY2209.6表A.2酪蛋白各亚型蛋白相关信息表亚型Uniprot代码氨基酸数目相对分子量Mw(Dalton即gmol)asl酪蛋白P02662(CASA1_BOVIN)21424529as2酪蛋白P02663(CASA2_B0VIN)22226019。酪蛋白P02666(CASB.BOVIN)22425107K酪蛋白P02668(CASK-BOVIN)19021269注：以上酪蛋白各亚型的分子量来源于UniProt数据库（h即:WWW.uniDmorg）,可通蛋白数据库代码在网站上查询酪蛋白相关参数。附录B酪蛋白检测流程示意图林取1旬固体样品或/H
24、OmL液体样品I号样品2样lI加入到惟形IK中后用30mLTris-HCI溶液溶解t10ml.NflCI取mAIOmLeillt溶解液甥60.水浴Ih.冷却后定容至50mL调1,体22P系的PHTiifltlnfwwl.依/,IooOOrnun痛心dft15un.a1.I消4Jjj液.收集沉淀蛋白款取OagJl粉原料或者l2mL液体乳5.1试样蛋白提取样中沉淀的责白向上述沉淀中加入TrisHCI溶液5mL步赛，2试样复溶步骤，45.4试样总蛋臼含量测定及拔样的翰R活“6or水浴*3011m11IOOOOrminOio.in,保留上清，呼?巴巴4液，未复溶鬣白一IKA认泥I沉淀重*提取一次，结合
25、L消液先后共两次总体林为lml.定总击门若择品中总版臼版的诙Kt不在0.207mg/InL之间.财富要稀收到此范州内A；记泉稀林侪数步骤54试样的解U溶的蛋门幡蜂液（已知总蛋白浓度）V定寿体改IC君定浓度Vfik解体枳5取上清液甲酸溶液分析在新ISmL的EP管中加入浓度为02）.7mInL之间的立海蚩门溶BoOIIL工作液（浓度均为2.SmoL,L）加乘并且定容ImL按37C16h再分别加入4OLWMIaOWnnn摘f百标W浪标计“二Hmin离心E*4MeBUM加20M510mm.校正腆蛋白薛漏切附录C酪蛋白标准溶液的多反应监测色谱图rtt三AYlXiYlJQUJl图DJ酪蛋白标准溶液(5molL)的多反应监测色谱图本方法负责起草单位：中国食品药品检定研究院。验证单位：浙江省食品药品检验研究院、上海市食品药品检验所、绿城农科检测技术有限公司、大连出入境检验检疫局检验检疫技术中心、酒泉市食品检验检测中心主要起草人：孙姗姗、刘柱、李晓雯、郝星凯、张晓林、李婷婷
